论文部分内容阅读
目的在脑缺血的治疗中,远程缺血后处理(Remote ischemia postconditioning,RIP)能减少缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤,然而,其机制未明。在本研究中,我们推测RIP对脑I/R损伤的神经保护作用是由内皮细胞释放的外泌体所介导的,探讨外泌体对人SH-SY5Y神经细胞I/R损伤后的影响。方法1.第一步建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型、远程缺血后处理模型,采用TTC染色、HE染色、免疫组织化学染色检测大鼠大脑组织,评估损伤程度。2.第二步建立人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)缺氧再灌注损伤模型(HUVEC I/R)及人SH-SY5Y神经细胞细胞缺氧再灌注模型(SH-SY5Y I/R),流式细胞术检测细胞凋亡情况,确定缺氧再灌注(I/R)时间;分别提取动物血清及HUVECs培养上清液中的外泌体(Exosome),电镜鉴定外泌体形态,粒径分析外泌体数量;采用免疫组化染色检测各组大鼠脑海马组织中外泌体标记蛋白CD63,HSP70,TSG101的表达量变化;Western blot与流式细胞仪检测血清中Exosome特异性蛋白CD63、HSP70和TSG101。3.第三步研究HUVEC来源外泌体对I/R损伤后的SH-SY5Y细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移及侵袭能力的影响,同时,检测凋亡相关分子Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达。结果1、成功建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型、远程缺血后处理模型;并检测再灌注24h后大鼠大脑梗死程度:a.TTC染色结果提示缺血后处理(RIP)组大鼠大脑缺血梗死体积明显较手术(Model)组减少,假手术组(Sham)无梗死;b.H&E染色结果显示假手术组大脑海马解剖结构完整,饱满,无明显凋亡;RIP组细胞萎缩,出现凋亡;Model组细胞萎缩及凋亡程度均较RIP组组明显加重;c.免疫组化染色结果提示RIP组和Model组大鼠大脑海马组织凋亡率较Sham组显著增高,且RIP组凋亡率低于Model组。2、成功建立HUVEC I/R损伤模型及SH-SY5Y I/R损伤模型,确定I/R时间为6h/24h;采用超速离心法成功提取血清及HUVECs培养上清液Exosome:a.免疫组化染色结果表明,Sham,Model,RIP各组大鼠脑海马组织中外泌体标记蛋白CD63,HSP70,TSG101的表达量无明显变化;b.透射电镜及粒径分析结果提示,外泌体形态呈圆形或椭圆形,直径在40-100nm之间,RIP组外泌体数量较Model组显著增高;c.Western Blot结果显示,各组血清中CD63,HSP70,TSG101蛋白均有表达,但RIP组较Sham,Model组表达量显著上升;流式细胞术结果表明,各组血清外泌体均表达CD63,HSP70,TSG101蛋白,且RIP组表达量较其余两组显著增高。3、CCK8实验及Edu实验结果提示HUVECs来源外泌体能有效减轻I/R损伤对SH-SY5Y细胞活力和增殖能力的影响。4、HUVECs来源外泌体对I/R损伤后SH-SY5Y细胞凋亡和细胞周期的影响:a.免疫荧光、流式细胞术、Hochest 33258实验结果表明I/R损伤后细胞凋亡显著增加,加入Exosome后能够有效减轻细胞凋亡;b.流式细胞术检测细胞周期结果提示:I/R损伤后周期阻滞在G0/G1期的SH-SY5Y细胞显著增多,S期细胞比例显著降低;与SH-SY5Y I/R组比较.SH-SY5Y I/R+Exo组在G0/G1期的细胞比例降低,S期细胞比例增高。5、HUVECs来源外泌体能有效恢复I/R损伤后SH-SY5Y细胞侵袭和迁移能力。6、qPCR及Western blot结果提示I/R损伤后细胞内Bax、Caspase-3的表达水平显著增高,Bcl-2表达水平显著降低;在Exosome处理后,I/R损伤后细胞内Bax、Caspase-3的表达水平被下调,Bcl-2表达水平被上调。结论1、RIP显著减少大鼠大脑缺血海马组织凋亡改变及缺血梗死体积。2、RIP增加大鼠血清外泌体数量及CD63,HSP70和TSG101的表达量。3、HUVECs来源外泌体能有效减轻I/R损伤对SH-SY5Y细胞活力和增殖能力的影响;HUVECs来源外泌体能有效恢复I/R损伤后SH-SY5Y细胞侵袭和迁移能力;并能够促进SH-SY5Y内相关抗凋亡基因的表达,提示外泌体有望成为治疗脑卒中的有效治疗手段之一。