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种质资源是植物育种工作的基础,而同源多倍体化是植物种质资源创新的重要手段之一。美洲商陆(Phytolacca americanaL.)是一种重要的中药植物,至今少见利用毛状根人工多倍体化进行种质创新的研究报道。本文以可自主生长的美洲商陆毛状根为诱变起始材料,采用秋水仙素人工诱变的方法获得其皂苷含量提高的多倍体毛状根,并运用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitiveamplification polymorphism, MSAP)技术以及外源5-azaC处理来分析美洲商陆毛状根多倍体新种质性状(商陆皂苷甲含量)和其DNA甲基化的相关性;以阐明毛状根同源多倍体创新美洲商陆新种质性状形成的分子机理。所获结果如下: 美洲商陆毛状根多倍体诱导的适宜条件为0.2%的秋水仙素处理36 h,其多倍体诱导率为100%,经根尖染色体鉴定法证实所获得的多倍体毛状根细胞的染色体数目为对照(二倍体)的二倍。 采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)对美洲商陆毛状根商陆皂苷甲含量的测定结果显示,无论是对照还是多倍体毛状根,其商陆皂苷甲含量的高效液相色谱特征峰的保留时间约为6.9min,而所获得的多倍体根系H和I中商陆皂苷甲含量分别为1.63%和1.78%,分别是对照(二倍体毛状根根系H和I)的1.83倍和1.52倍。 对美洲商陆毛状根多倍体基因组DNA的MSAP分析结果显示,与原二倍体相比,美洲商陆毛状根在多倍体化过程中,DNA甲基化水平的变化不大,根系H和I分别下降了1.5%和0.8%,;而DNA甲基化模式却发生了明显的变化,根系H和I分别有73.2%和76.7%的甲基化位点的甲基化状态发生了改变,其中以过甲基化和超甲基化为主,分别为39.8%和39.8%,而去甲基化分别为16.3%和17.5%,次甲基化分别为17.1%和19.4%。这说明美洲商陆毛状根在多倍体化过程中无DNA甲基化水平的变异,但具有非常显著的DNA甲基化模式变化。 而采用外源不同浓度5-azaC与美洲商陆多倍体毛状根H根系共培养20d后发现,与对照相比12.5μM和25μM低浓度5-azaC处理的根系形态及其生物量与对照相当,但高浓度50μM和100μM5-azaC处理则使根系变褐,降低根系生物量。25μM5-azaC处理美洲商陆多倍体毛状根根系H和I后,其商陆皂苷甲含量分别是原多倍体毛状根的122.9%和108.9%。MSAP分析表明,与对照相比,外源去甲基化试剂5-azaC处理的美洲商陆多倍体毛状根根系H和I的DNA甲基化水平变化不大,但其DNA甲基化模式则较对照发生显著变化,分别有68.3%和75.0%的位点的甲基化状态发生了改变,其中以胞嘧啶甲基化的去除(去甲基化和次甲基化)为主,分别达到42.6%和47.6%,而过甲基化或超甲基化则分别为25.7%和27.4%。 本文研究表明,美洲商陆毛状根可作为同源多倍体诱导良好的起始材料,且多倍体新种质(商陆皂苷甲含量)的形成可能与其基因组DNA甲基化模式的变化有一定的关系。