目的：获得正常人asGNLY cDNA序列，寻找合适的突变位点，采用PcR法对其进行定点突变，并将天然型与突变型分别在大肠杆菌中融合表达，为进一步研究人GNLY结构与功能的关系奠定基础。 方法：根据Genebank中登录的人GNLY cDNA序列设计asGNLY RT-PCR引物，并在上游引物的5端加上EcoRI酶切位点，在下游引物的5端加上SalI酶切位点。应用淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离获得人外周单个核细胞，用同种异型抗原或者PHA、rIL-2激活健康人淋巴细胞(主要指T淋巴细胞)，抽提总RNA。应用RT-PCR扩增出asGNLY cDNA序列，将其与克隆载体puC18经EcoRI和SalI双酶切、连接、转化大肠杆菌DH5α，经α互补筛选，挑出阳性菌落，抽提重组质粒鉴定后测序，测序正确后将阳性重组质粒和表达载体pGEX-4T-1经EcoRI和SalI双酶切、连接、转化大肠杆菌BL21，经筛选后挑取菌落，抽提重组质粒鉴定后测序。将鉴定为阳性的重组质粒用IPTG 37℃诱导表达2～5小时，全菌体蛋白SDS-PAGE电泳观察表达结果。收集含融合蛋白的大肠杆菌BL21，使用GST融合蛋白纯化试剂盒裂解包涵体，纯化融合蛋白，用凝血酶切割融合蛋白，最后通过抑菌圈实验初步鉴定asGNLY的抗菌活性。根据人颗粒溶素结构，寻找合适的突变位点，设计突变引物，用突变试剂盒对43、47位(人颗粒溶素成熟肽序列号)进行定点突变，表达突变体，抽提突变重组质粒鉴定后测序。 结果： 1、经RT-PCR从激活的人外周血单个核细胞中扩增出了103bp的片段(包含两端RT-PCR上下游引物添加的酶切位点及4个保护碱基)。测序结果表明扩增出的asGNLY cDNA序列与预期设计的序列一致。 2、人asGNLY基因与融合表达载体连接、转化大肠杆菌BL21，抽提重组质粒鉴定，测序结果表明人asGNLY基因与融合表达载体连接方向正确，可以进行诱导表达。 3、经IPTG37℃诱导表达2～5小时，SDS-PAGE电泳结果可见约29KD的融合蛋白条带。收集含融合蛋白的大肠杆菌BL21，使用GST融合蛋白纯化试剂盒裂解包涵体，纯化、溶解融合蛋白。 4、用凝血酶对融合蛋白切割分离GST和人asGNLY蛋白，初步纯化asGNLY蛋白后通过抑菌圈实验鉴定抗菌活性，尚未表现出对金黄色葡萄球菌ATCC25938、白色念株菌ATCC64550的抗菌作用。 5、使用PCR突变试剂盒对asGNLY cDNA进行定点突变。masGNLY连接体转化大肠杆菌BL21。抽提重组质粒鉴定，测序结果表明43位编码天冬氨酸密码子GAC突变为苏氨酸密码子ACC，47位编码天冬酰胺密码子AAU突变为精氨酸密码子CGC，达到预期突变结果。 结论：成功构建了人asGNLY及masGNLY cDNA，并在大肠杆菌中诱导表达成功。且将asGNLY基因表达产物进行了初步纯化。为天然蛋白、突变蛋白的进一步纯化、复性、抗菌活性的定量测定奠定了基础。