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第一部分一氧化碳释放分子-对小鼠可逆性肾缺血再灌注损伤的保护作用[摘要]目的探讨一化碳释放氧分子CORM-2对小鼠可逆性肾缺血再灌注损伤的保护作用。方法建立小鼠原位肾缺血再灌注损伤模型,在环境温度32℃下完全阻断小鼠左肾血流40分钟,然后恢复其血流灌注,同时切除小鼠对侧肾脏。于术前1小时静脉给予CORM-2(20mg/kg)或已完全释放CO的iCORM-2。取再灌注24小时后的全血血浆检测肾功能和肾脏标本行HE染色检查,评价其肾脏组织损伤程度。另外,取再灌注1、3、7天后全血血浆,检测肌酐和尿素氮水平评价其肾功能变化情况,并通过对小鼠肾脏标本进行免疫组织化学和免疫荧光检测,观察小鼠肾功能恢复过程中炎症反应的变化情况。结果小鼠肾脏经历热缺血再灌注后出现明显肾功能损害(IRI组vs. sham组,P<0.05),然而,于术前1小时静脉给予CORM-2治疗后,小鼠肾脏经历热缺血40分钟,再灌注24小时,肌酐和尿素氮升高水平明显降低,肾功能得到显著保护,与假手术组相比无显著差异(CORM-2组·vs. Sham组P>0.05),与IRI组、iCORM-2组相比有显著差异(CORM-2组vs. IRI组,CORM-2组vs. iCORM-2组,P<0.05)。组织病理学检查发现,热缺血再灌注损伤可以破坏肾脏中肾小管上皮细胞并最终发生凋亡坏死。CORM-2治疗显著减轻肾小管上皮细胞的凋亡坏死,从而保护了肾功能。小鼠肾脏经历热缺血再灌注损伤后,肾脏组织中出现大量MPO阳性中心粒细胞,介导急性炎症反应。MPO阳性中性粒细胞主要出现在灌注后早期,第3天浸润最多,到灌注第7天MPO阳性中性粒细胞浸润逐渐减少。小鼠肾缺血再灌注损伤肾脏组织中浸润的淋巴细胞主要是CD3、CD8阳性T淋巴细胞,出现在灌注后期第7天。CORM-2治疗组MPO阳性中性粒细胞浸润明显减少(CORM-2组vs.IRI组、iCORM-2组,P<0.0),到灌注后期第7天T淋巴细胞浸润也被明显抑制。免疫荧光检查也显示TNF-α参与了缺血再灌注损伤中的炎症反应,主要出现在早期灌注第1天和第3天,CORM-2治疗显著减少了组织中TNF-α的产生。结论CORM-2通过显著减轻了小鼠肾缺血再灌注中的炎症反应从而发挥保护功能。第二部分一氧化碳释放分子对小鼠致死性肾缺血再灌注损伤的保护作用[摘要]目的探讨一氧化碳释放分子CORM-2对小鼠致死性肾缺血再灌注损伤的保护作用。方法建立小鼠致死性肾缺血再灌注损伤模型,在环境温度32℃下完全阻断小鼠左肾血流50分钟,然后恢复其血流,同时切除小鼠对侧肾脏,观察小鼠存活情况。于术前1小时静脉给予一氧化碳释放分子CORM-2治疗。并取再灌注24小时的全血血浆,检测肌酐和尿素氮水平评价其肾功能情况。另外,取再灌注24小时的肾脏标本行HE、TUNEL、CD31免疫荧光染色检查评价肾脏组织损伤程度。通过免疫组织化学和实时定量PCR检测炎性细胞浸润及炎性因子产生情况,观察小鼠肾缺血再灌注损伤中炎症反应程度。结果小鼠肾脏经历50分钟热缺血再灌注后,出现严重缺血再灌注损伤,并最终导致小鼠死亡。缺血前1小时给予CORM-2治疗可以显著抑制小鼠的肾IRI死亡,所有小鼠全部存活。组织病理学检查发现,肾脏的缺血再灌注损伤严重破坏了肾小管上皮细胞和毛细血管内皮细胞,并最终发生凋亡坏死。CORM-2治疗显著保护了上述两种细胞的完整性,并减少其发生凋亡坏死,从而保护了肾功能。另外,损伤肾脏组织中广泛出现大量MPO阳性中心粒细胞浸润,介导急性炎症反应。CORM-2治疗组中MPO阳性中性粒细胞浸润明显减少(CORM-2组vs. IRI组、iCORM-2组,P<0.05)。实时定量PCR检测发现IRI肾组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等mRNA表达上调。免疫荧光检查也显示TNF-α参与了缺血再灌注损伤中的炎症反应,CORM-2治疗显著抑制了炎性因子mRNA表达上调,减少了组织中TNF-α的产生。结论一氧化碳释放分子CORM-2通过释放CO可以发挥显著的肾脏保护作用,抵御致死性的小鼠肾缺血再灌注损伤。第三部分一氧化碳释放分子对致死性IRI的保护作用与其显著抑制HMGB1释放有关[摘要]目的探讨一氧化碳释放分子CORM-2在小鼠缺血再灌注损伤中发挥保护作用与肾实质细胞HMGB1迁移释放的关系。方法建立小鼠致死性肾脏缺血再灌注损伤模型,检测肾脏缺血后组织中危险因子HMGB1的变化及迁移释放,同时检测给予CORM-2治疗对肾IRI中HMGB1迁移释放的影响。分离原代小鼠肾小管上皮细胞体外低氧培养,通过免疫荧光和免疫共沉淀检测细胞中HMGB1的迁移释放和乙酰化修饰,以及CORM-2治疗对HMGB1迁移释放和乙酰化修饰的影响。另外,Western Blot和免疫共沉淀检测原代小鼠肾小管上皮细胞经H202氧化应激损伤刺激后HMGB1的迁移释放和乙酰化修饰,给予CORM-2治疗探讨其发挥的保护作用及其效应的机制。结果在小鼠肾脏缺血损伤早期,肾脏上皮细胞大量HMGB1从胞核迁移至胞浆并释放至循环,从而启动的炎症反应,导致肾小管上皮细胞发生凋亡坏死。而缺血前1小时给予CORM-2治疗可以明显减少HMGB1的核浆迁移释放。病理及Western Blot检测显示缺血损伤后,肾小管上皮细胞核中HMGB1明显释放,CORM-2治疗后肾小管上皮细胞核中HMGB1释放不明显(CORM-2组vs.IRI组,P<0.05)。原代小鼠肾小管上皮细胞在低氧和H202刺激实验中,大量HMGB1出现核浆迁移,免疫荧光和免疫共沉淀检测分别显示CORM-2治疗可以显著抑制原代小鼠肾小管上皮细胞经低氧或H202刺激损伤后HMGB1的迁移释放和乙酰化修饰,从而保护肾小管上皮细胞抵御低氧或氧化应激损伤。结论在缺血再灌注损伤早期,CORM-2可以显著减少肾小管上皮细胞中HMGB1乙酰化修饰,抑制HMGB1核浆迁移释放,从而阻断炎症反应,减轻缺血再灌注损伤。第四部分一氧化碳释放分子对小鼠缺血再灌注损伤的保护作用与肾组织HO-1表达的关系[摘要]目的探讨一氧化碳释放分子CORM-2在小鼠肾缺血再灌注损伤中的保护效应与组织HO-1表达的关系。方法应用CORM-2、iCORM-2或CoPP预处理,在不同时间点检测小鼠肾脏组织中的HO-1表达水平,并以此为依据建立肾脏缺血再灌注损伤模型,并观察不同不同预处理对肾脏的保护效应。取缺血再灌注损伤后24小时血浆检测Cr和BUN水平,并收集肾脏标本行HE、TUNEL、CD31免疫荧光、MPO免疫组化和TNF-α免疫荧光检测,评价肾脏损伤和炎症反应程度。结果免疫组化及Western Blot检测显示CORM-2、iCORM-2以及CoPP给药24小时后明显上调肾小管上皮HO-1表达水平,但对致死性的肾缺血再灌注损伤的保护作用有限。CORM-2给药1小时,肾小管上皮细胞HO-1上调表达不明显,而CORM-2术前1小时给药明显减轻肾缺血再灌注损伤,保护肾功能(vs.IRI组、CORM-2-24h组、iCORM-2-24h组和CoPP组,P<0.05),并明显减轻了肾小管上皮细胞(TUNEL)和毛细血管内皮的凋亡(CD31),抑制了肾间质中性粒细胞(MPO)浸润以及炎性因子(TNF-α)产生。结论CORM-2对缺血再灌注损伤的保护是通过释放的CO直接发挥作用,其主要保护作用与HO-1表达无明显相关。