【摘 要】
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金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)是由金黄色葡萄球菌分泌产生的一种外毒素,也是一种超抗原。SEB能够非特异性地激活免疫细胞,尤其是T细胞。产生众多细胞因子,能够提高特异性抗原
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金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)是由金黄色葡萄球菌分泌产生的一种外毒素,也是一种超抗原。SEB能够非特异性地激活免疫细胞,尤其是T细胞。产生众多细胞因子,能够提高特异性抗原的免疫原性。因而SEB具备成为免疫佐剂的潜力。但由于SEB对人和哺乳动物具有较大的毒副作用,因此其佐剂活性在畜牧兽医领域的应用受到限制。为了减轻或消除SEB的毒性作用,我们通过PCR定点突变技术,构建SEB突变体(N23S,H32N和K172E),筛选出超抗原活性较好的突变体。同时研究SEB及其突变体在肉鸡体内的安全性及其佐剂活性,为促进SEB作为免疫佐剂在兽医领域的应用奠定基础。本试验主要包括三个部分工作:1.获得SEB突变重组蛋白利用PCR方法对SEB的3个关键抗原位点进行突变,包括N23S,H32N和K172E,并构建了原核表达质粒p ET-28a-SEB,p ET-28a-SEBM23(N23S),p ET-28a-SEBM32(H32N),p ET-28a-SEBM172(K172E),p ET-28a-SEBM23/172(N23S+K172E),p ET-28a-SEBM32/172(H32N+K172E),p ET-28a-SEBM23/32/172(N23S+H32N+K172E)。在大肠杆菌中诱导表达并纯化获得7种重组蛋白。2.SEB及其突变体SEBM32/172对AIV-H9/NDV二联灭活苗的佐剂作用分别用重组蛋白SEB和SEBM32/172配合H9亚型禽流感、新城疫二联灭活苗免疫肉鸡,通过HI实验和MTT实验评价SEB及其突变体SEBM32/172对灭活疫苗的佐剂作用。结果显示在免疫后第14-28天5μg SEBM32/172能不同程度的提高灭活疫苗中AIV-H9的免疫效果,对NDV的作用不明显;1μg或10μg SEBM32/172和SEB的对灭活疫苗的佐剂效应不稳定。淋巴细胞活性检测结果显示1μg SEB和5μg SEBM32/172在免疫后第7天显著高于疫苗对照组,其他时间段存在一定差异。3.SEB及其突变体SEBM32/172在肉鸡体内的安全性评价为了研究突变SEBM32/172后能否降低SEB对机体毒性作用,我们用10倍佐剂剂量(50μg/只)的重组蛋白SEB和SEBM32/172分别肌肉注射肉鸡,分别在接种后第7、14、21天进行剖检取样制备组织病理切片,进行病理学观察。在试验过程中肉鸡表现正常,脏器没有明显的肉眼可见的组织病变,但在显微镜下,实验组肉鸡的肾脏存在不同程度的病理损伤,如肾小管变性坏死、肾小球肿大、肾小球肾炎等,病理损伤程度随时间的增加而加重,而SEBM32/172组的病理损伤比SEB组的病理损伤程度低,表明双突变SEBH32NK172E能降低SEB对肉鸡的毒性作用。
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