副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是一种寄生在猪上呼吸道的条件性致病细菌,当猪上呼吸道的防御系统受到环境中的应激因素和致病条件破坏时,副猪嗜血杆菌能侵入宿主而引发以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要病理特征的革拉氏病,严重危害猪群尤其是仔猪和保育猪的健康。本课题前期研究表明虎杖中的主要成分大黄素对副猪嗜血杆菌具有较强的抑菌活性,但大黄素作为广谱抗菌药物,有关其系统深入的抗菌作用机制研究却鲜有报道。因此,本研究首先评价大黄素对副猪嗜血杆菌的体外抗菌特性,再在此基础上应用iTRAQ-LC-MS/MS高通量蛋白质组学技术结合生物信息学分析差异表达蛋白,并对大黄素影响副猪嗜血杆菌粘附侵袭细胞、抗吞噬、抗血清补体杀伤、诱导炎症因子产生的相关功能进行验证,阐明其抗菌作用分子机制,为作用靶点的挖掘提供理论依据。主要研究内容及结果如下:1.大黄素对副猪嗜血杆菌的体外抗菌特性研究分别采用微量肉汤稀释法和琼脂平板计数法测定大黄素对副猪嗜血杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimal bacte-ricidal concentration,MBC),在不同浓度大黄素作用下通过绘制体外时间-杀菌曲线分析大黄素浓度与抗菌效果的关系,并对2MIC、MIC、1/2MIC三个浓度大黄素作用后副猪嗜血杆菌的蛋白表达谱进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析。结果显示:①大黄素对副猪嗜血杆菌的MIC和MBC分别为32μg/mL和64μg/mL。②时间-杀菌曲线显示1/2MIC及以下浓度大黄素作用时细菌生长趋势与正常组相同,繁殖速度减缓;MIC大黄素作用时细菌菌量下降且保持在一定范围;2MIC和4MIC大黄素作用时,细菌直接进入衰亡期,分别在6h和4h完全被杀死。③SDS-PAGE显示正常细菌的蛋白条带多且清晰,而经大黄素作用后的细菌蛋白条带变浅变窄,且随着药物浓度的增加蛋白条带逐渐变浅变窄,在2MIC时某些条带甚至消失。以上结果表明大黄素对副猪嗜血杆菌具有良好的抗菌效果,为浓度依赖型的抗菌药物,且对副猪嗜血杆菌蛋白质的表达具有一定抑制作用。2.基于iTRAQ技术大黄素作用副猪嗜血杆菌的蛋白质组学研究应用等重同位素相对标记和绝对定量与毛细管高效液相色谱及质谱联用(iTRAQ-LC-MS/MS)的高通量蛋白质生物质谱技术进行大黄素处理组与未处理对照组细菌蛋白质谱的表达分析,经Mascot查库进行蛋白鉴定,并比较得到差异表达蛋白,结合生物信息学方法,分析差异表达蛋白的功能。结果显示:①共鉴定到总蛋白2219个,其中表达量变化1.2倍以上(Ratio>1.2或Ratio<0.83且P value<0.05)的338个,包括上调蛋白95个,下调蛋白243个。②对表达量变化1.2倍以上的差异蛋白进行基因本体数据库(Gene Ontology,GO)注释分析,差异蛋白主要参与了细胞、细胞膜、生物大分子等8种细胞组成;代谢过程和细胞过程等12个生物过程;催化活性和结合作用等10个分子功能。其中,下调表达的30S-S8、50S-L2、50S-L4等细菌核糖体组件及FtsB、FtsL、FtsQ等细胞分裂蛋白在3个GO体系中均有注释。③对表达量变化1.2倍以上的差异蛋白进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路注释富集分析,这些蛋白主要富集在ABC转运系统、碳水化合物代谢、细菌趋化性、三羧酸循环及毒力因子表达等途径。蛋白组学研究结果表明:大黄素可能主要通过抑制核糖体合成,使调控营养摄取的ABC转运系统与能量代谢的碳水化合物代谢通路以及细菌细胞分裂蛋白中的某些关键蛋白表达受到抑制,从而影响副猪嗜血杆菌的生长繁殖;同时可调控外膜蛋白P2(Outer membrane protein P2,OmpP2)、外膜蛋白 P5(Outer membrane protein P5,OmpP5)、神经氨酸酶等毒力因子的蛋白表达。3.大黄素对差异毒力因子基因转录的调节作用研究以ppiB作为内参基因,通过建立RT-PCR方法,采用2-△△ct法分析数据,检测大黄素对ompP2、ompP5、nanH、gnd、vtaA2、vtaA4等毒力因子基因转录的影响。结果显示:该方法特异性良好、灵敏度高,大黄素作用后,gnd基因mRNA的相对表达量>1,其他基因的mRNA相对表达量均<1。由此说明大黄素能促进gnd基因的转录,同时对 ompP2、ompP5、nanH、vtaA2、vtaA4、vtaA6、vtaA11、vtaA16基因的转录具有抑制作用,表明大黄素作用后这些毒力因子的基因转录水平和蛋白表达水平一致。4.大黄素对差异毒力因子相关功能的影响研究为了验证大黄素作用后差异毒力因子蛋白表达量发生变化是否导致相应功能发生改变,首先用CCK-8法筛选大黄素对供试细胞的安全作用浓度,再采用菌落计数法分别测定大黄素对副猪嗜血杆菌粘附侵袭细胞、抗吞噬、以及抵抗血清补体杀伤能力的影响,并通过构建副猪嗜血杆菌诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的模型,检测大黄素对IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α释放的影响。结果显示:①大黄素对供试细胞的安全作用浓度均为16μg/mL及以下。②不同浓度大黄素作用后,副猪嗜血杆菌对猪肾上皮细胞PK-15细胞的粘附率和侵袭率均低于正常对照组,其中16μg/mL和8μg/mL大黄素作用后的副猪嗜血杆菌粘附率和侵袭率显著下降(P<0.05)。③与正常对照组相比,猪肺泡巨噬细胞PAM细胞对16μg/mL和8μg/mL大黄素作用后的副猪嗜血杆菌的吞噬率显著增加(P<0.05),分别为12.43%和9.10%。④16μg/mL大黄素作用后,副猪嗜血杆菌在不同浓度猪血清中的存活率均降低,其中正常菌株在90%的猪血清中存活率为1.24%,而大黄素作用后,细菌被完全杀死。⑤在副猪嗜血杆菌诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的模型中,最佳细菌感染量是109CFU/mL,最佳作用时间为6h。大黄素呈浓度依赖性的抑制IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的释放。以上结果表明大黄素能降低副猪嗜血杆菌对PK-15细胞的粘附侵袭能力,减弱副猪嗜血杆菌对PAM细胞吞噬和血清补体杀伤的抵抗能力,并抑制炎症因子的释放。而这些功能的改变与差异毒力因子有关,其中OmpP2蛋白的下调可能是最关键的因素。综上所述,大黄素对副猪嗜血杆菌具有良好的体外抗菌作用,其作用机制主要体现在两个方面:一是可能通过调控核糖体的合成,使ABC转运系统与碳水化合物代谢通路中的某些关键蛋白表达受到抑制而减弱细菌的物质能量活动,以及下调细胞分裂相关蛋白的表达而抑制细菌二分裂的进行,最终达到抑制细菌生长的效果;二是可以通过抑制部分毒力因子的转录和表达来减弱副猪嗜血杆菌对宿主的感染致病能力。