研究背景特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种慢性反复发作的炎症性皮肤病,以剧烈瘙痒和湿疹样损害为主要特征,好发于儿童,属于中医“四弯风”、“胎歛疮”等的范畴。在全球多数国家,AD均具有较高患病率,近年来,在我国更呈上升趋势。现代医学认为,AD的发病与遗传、环境、免疫等因素均相关,主要与表皮屏障功能损伤、先天性或获得性免疫反应失调关系密切;中医认为,其多由禀赋不耐,外感淫邪,饮食失调,致心火过胜,脾虚失运而发病。儿童期以心火脾虚交织互见为主,由心火扰神,脾虚失运,湿热蕴结肌肤而致。故在治疗中,往往注重调摄心脾,脾虚湿蕴者主要采用健脾渗湿法。皮炎Ⅱ号方是课题组根据临床经验,在健脾、渗湿为治法的基础上,对龙牡汤进行加减而成的经验方,药性平和,祛湿健脾、清热疏风兼顾,标本兼治,在减轻皮损、减少渗出、缓解临床症状等方面取得较好疗效。本研究在前期基础上,首先建立AD小鼠模型,研究AD发病中肠道菌群的特点,并对皮炎Ⅱ号方在干预AD病情方面做出药效评价;其次建立肠道菌群紊乱相关型AD小鼠模型,研究皮炎Ⅱ号方干预其病情的可能机制。目的及意义(1)采用免疫损伤的方法建立AD小鼠模型,研究肠道菌群在AD发病中的变化特点;(2)采用抗生素灌胃加免疫损伤的方法建立肠道菌群紊乱的AD小鼠模型,研究肠道菌群紊乱状态下AD的病变特点;(3)通过上述两种AD模型,对皮炎Ⅱ号方进行药效评价,揭示其干预AD的可能机制,为运用健脾渗湿法治疗AD提供理论基础;(4)根据中医“诸湿肿满,皆属于脾”的病机理论,推测健脾渗湿法在干预AD应用中的合理性、可行性。方法实验一:第1周,用2%的2,4-二硝基氯苯(DNCB)外涂BALB/c小鼠背部皮肤进行2次致敏,用量为200μl/次,每次间隔3天;第2-5周,用0.2%DNCB外涂同样部位致敏,用量为200 μl/次,2次/周,每次间隔3天。第3-5周,用浓度分别为2.5g/ml、5.0g/ml的皮炎Ⅱ号方提取液灌胃,用量为0.2ml/次,1次/天。皮炎Ⅱ号方组成为:滑石粉、煅牡蛎、炒神曲、茯苓皮、连翘、麻黄根。进行上述AD诱导与药物灌胃后,通过皮损评分、皮肤组织病理评价皮损严重程度,通过免疫印迹法(western blot)检测皮损中Toll样受体2(Toll like receptors 2,TLR2)、兜甲蛋白(loricrin,LOR)、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)含量差异,评价各蛋白表达水平;通过流式细胞检测法检测血清IFN-γ、TNF-α、IL-1α、IL-4、IL-5水平,通过ELISA方法检测血清IgE水平;通过DNA电泳与荧光技术分析小鼠结肠内容物细菌总浓度及菌落组成。实验二:第1周,用200mg/ml头孢曲松钠对BALB/c小鼠进行连续灌胃,用量0.2ml/次,2次/天,每次间隔6小时。第2周,用2%DNCB外涂背部皮肤致敏2次,用量200 μl/次,每次间隔3天。第3-5周,分别用0.1%、0.2%DNCB在同样部位致敏,用量均为200 μl/次,2次/周,每次间隔3天。第4-5周,用浓度分别为2.5g/ml、5.0g/ml的皮炎Ⅱ号方提取液灌胃,用量为0.2ml/次,1次/天。皮炎Ⅱ号方组成同实验一。进行上述肠道菌群干预、AD样皮损诱导、药物灌胃后,对小鼠皮损外观、皮肤组织病理及皮肤中蛋白含量、血清IgE、血清细胞因子和肠道菌群差异进行评价,评价方法同实验一。结果1.外用致敏液涂擦后,小鼠背部裸露皮肤均可见脱屑、结痂;皮损病理可见表皮增厚、角化过度、真皮炎细胞浸润等AD样改变;血清中IgE、TNF-α、IL-1α、IL-4、IL-5显著升高,IFN-γ显著降低(P<0.01)。采用免疫损伤方法建立AD小鼠模型成功。2.采用免疫损伤方法建立AD小鼠模型,其肠道菌群的Shannon指数显著降低(P<0.01),菌群多样性显著下降。3.采用免疫损伤方法建立AD小鼠模型,不同剂量的皮炎Ⅱ号方提取液灌胃均可改善皮损组织病理,降低血清IgE及细胞因子水平。大剂量的皮炎Ⅱ号方提取液可显著降低血清IgE、TNF-α、IL-1α、IL-4、IL-5水平,显著升高IFN-γ水平(均为 P<0.01)。4.采用抗生素灌胃联合免疫损伤的方法,建立肠道菌群紊乱相关型AD小鼠模型。不同剂量的皮炎Ⅱ号方提取液灌胃均可改善皮损组织病理。大剂量皮炎Ⅱ号方提取液可显著降低血清TNF-α、IL-1α、IL-4、IL-5水平,显著升高IFN-γ水平(均为 P<0.01)。5.在提高肠道菌群紊乱相关型AD小鼠模型的Chao、ACE、Shannon指数方面,皮炎Ⅱ号方提取液的药物剂量效应显著(P<0.01),剂量越大,各指数越高,菌群的丰富度和多样性越高。结论1.采用免疫损伤的方法建立AD小鼠模型,及采用抗生素灌胃联合免疫损伤的方法建立肠道菌群紊乱相关型AD小鼠模型,两种模型均造模成功。2.在与人为干预肠道菌群相关或不相关的AD小鼠模型中,皮炎Ⅱ号方提取液均可在一定程度上改善皮损组织病理,有效改善血清IgE及细胞因子水平,利于机体的免疫反应由Th2型向Th1型转变。3.在人为导致肠道菌群紊乱相关型AD小鼠模型中,大剂量皮炎Ⅱ号方提取液可有效提高肠道菌群丰富性与多样性,其作用机制可能与改善肠道菌群相关。