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目的舌鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤,中晚期舌鳞癌往往侵犯瘤周软组织,并伴有颈部淋巴结或远处转移,研究显示复发和转移是影响舌鳞癌预后的重要因素。近年来尽管以手术为主的综合治疗有了长足的发展,但是其5年生存率仍然徘徊在50%左右,难以得到有效提高。因此中晚期舌鳞癌仍是头颈部恶性肿瘤领域的难治性疾病,阐明其发生、转移机理,寻找新的治疗手段日益受到重视。研究显示Bcl-2、Twist1、EMT在肿瘤的发生、发展特别是侵袭转移中发挥着重要作用,但Bcl-2与Twist1是否相互协同通过EMT参与舌鳞癌侵袭转移的机制探讨甚少。本研究旨在探讨Bcl-2、Twist1在舌鳞癌中的表达与舌鳞癌临床病理特征间的相关性及其对EMT的调控。方法1.免疫组化:收集标本:实验组为82例临床舌鳞癌手术标本,对照组为24例癌旁组织;通过免疫组织化学染色法检测舌鳞癌标本中Bcl-2、Twist1、神经钙黏素、波形蛋白、钙黏着蛋白表达;χ2检验或Fisher确切检验分析分析舌鳞癌临床病理特征与Bcl-2、Twist1及神经钙黏素、波形蛋白、钙黏着蛋白间的关系。应用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析,计数资料用χ2或Fisher确切概率法及Spearman相关性分析行统计学处理。2.蛋白质印迹法检测Bcl-2、Twist1、EMT相关因子表达情况;通过免疫共沉淀法检测Bcl-2、Twist1的相互相用情况;免疫荧光方法检测Bcl-2、Twist1的定位情况。结果1.免疫组织化学结果:Bcl-2、Twist1及EMT相关因子在舌鳞癌中的表达与临床病理间的相关性:在细胞核膜上发现Bcl-2阳性表达,Twist1阳性表达定位于胞核,波形蛋白阳性表达定位于细胞质,神经钙黏素、钙黏着蛋白阳性表达定位于细胞膜,少数表达于细胞质。82例舌鳞癌组织中46例Twist1呈阳性表达,24例癌旁组织中4例Twist1呈阳性表达,Twist1在舌鳞癌组织中表达明显高于癌旁组织(P=0.001)。Bcl-2高表达见于48例舌鳞癌组织和6例癌旁组织,Bcl-2在舌鳞癌组织与癌旁组织的表达有差异同样具有统计学意义(p=0.005)。Bcl-2、Twist1、神经钙黏素、波形蛋白在中低分化组和淋巴结转移组的表达均显著高于高分化组和非淋巴结转移组(Bcl-2:P=0.040和P=0.012;Twist1:P=0.013和P=0.003;神经钙粘素:P=0.014和P=0.044;波形蛋白:P=0.041和P=0.012),而钙黏着蛋白在高分化组及非淋巴结转移组表达高于中低分化组及淋巴结转移组(P<0.05)。Bcl-2、Twist1、神经钙黏素、波形蛋白、钙黏着蛋白在患者不同性别,年龄,肿瘤T分期无统计学意义,Bcl-2、Twist1与EMT相关因子进行相关性分析得出,Bcl-2表达与Twist1、神经钙黏素、波形蛋白呈正相关,而与钙黏着蛋白的表达呈负相关;Twist1表达与Bcl-2、神经钙黏素、波形蛋白表达呈正相关,与钙黏着蛋白的表达呈负相关。2.体外实验部分:蛋白质印迹法检测舌鳞癌TB3.1细胞系中Bcl-2、Twist1、EMT相关因子表达情况:Bcl-2、Twist1、神经钙黏素及波形蛋白随乏氧时间延长表达明显上调,而钙黏着素明显下调。免疫共沉淀法检测Bcl-2、Twist1的相互作用情况,结果显示:正常和乏氧情况下均见Bcl-2抗体沉降的细胞裂解产物中Twist1阳性,Twist1抗体沉降细胞裂解产物反向验证同样出现Bcl-2阳性。免疫荧光法检测Bcl-2、Twist1蛋白表达情况:乏氧后Bcl-2、Twist1、明显上调并存在定位重合现象。结论1.Bcl-2、Twist1在舌鳞癌组织中呈高表达,在癌旁组织中呈低表达。结合临床病理资料分析发现组织分化程度、淋巴结转移有统计学意义,说明舌鳞癌中Bcl-2、Twist1的异常表达可以促进淋巴结转移,导致肿瘤异型性增加,进而导致肿瘤恶性程度增加。这一切预示着检测Bcl-2、Twist1蛋白的表达水平可能作为预测肿瘤淋巴转移能力参考指标,Bcl-2、Twist1可以作为肿瘤的分子标签,具有重要的临床意义。2.神经钙黏素、波形蛋白、钙黏着蛋白等EMT相关标志性蛋白在舌鳞癌淋巴结转移组和非转移组中的表达有显著差异,证明EMT能促进淋巴结转移,并在舌鳞癌中这一现象广泛存在。Bcl-2、Twist1、神经钙黏素、波形蛋白在中低分化组和淋巴结转移组的表达均显著高于高分化组和非淋巴结转移组,而在高分化组及非淋巴结转移组发现钙黏着蛋白呈现高表达,明显高于中低分化组及淋巴结转移组,说明Bcl-2、Twist1与EMT间有某种相关性。综上所述我们推测Bcl-2、Twist1通过调控EMT进而影响肿瘤的发生发展。3.蛋白质印迹法检测Bcl-2、Twist1、EMT相关因子表达情况:Bcl-2、Twist1、神经钙黏素及波形蛋白随乏氧时间延长表达明显上调,而钙黏着素明显下调。证明了Bcl-2、Twist1在体外实验中高表达并与EMT相关蛋白的表达具有相关性,进一步验证了体内实验的结果。免疫共沉淀法检测Bcl-2、Twist1的相互相用情况,结果显示:正常和乏氧情况下均见Bcl-2抗体沉降的细胞裂解产物中Twist1阳性,Twist1抗体沉降细胞裂解产物反向验证同样出现Bcl-2阳性。通过免疫荧光法检测Bcl-2、Twist1蛋白表达情况:乏氧后Bcl-2、Twist1、明显上调并存在定位重合现象。由此可见,Bcl-2、Twist1在舌鳞癌细胞内存在直接相互作用,即二者形成Bcl-2/Twist1复合体,这些研究提示,舌鳞癌中Bcl-2可能在乏氧情况下穿梭入细胞核与Twist1结合形成复合体进而促进舌鳞癌中EMT的发生。