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目的:Ghrelin是促生长激素分泌物受体的内源性配体,主要由胃黏膜的内分泌细胞产生,并具有多种生理功能,如促进代谢、诱导摄食、促进胃动力,除此以外,Ghrelin还参与多种与肿瘤发展相关的生理过程,如促进癌细胞的增殖及转移,抑制癌细胞凋亡。甲状腺癌(Thyroid Carcinoma,TC)是最常见的头颈部恶性肿瘤之一。有研究显示,甲状腺髓样癌组织有大量Ghrelin受体表达,是否Ghrelin可促进甲状腺髓样癌细胞增殖?是否Ghrelin与甲状腺髓样癌发生发展有关?尽管已有大量对Ghrelin促细胞增殖的研究,但关于Ghrelin促细胞增殖的机制研究较少,尤其是Ghrelin促甲状腺髓样癌细胞增殖机制研究几近空白。故本研究将通过离体和在体研究,观察Ghrelin对甲状腺髓样癌细胞增殖或移植瘤生长的影响及可能潜在机制,为临床甲状腺恶性肿瘤的防治提供新的思路和可信实验依据。方法:1.体外细胞研究:(1)Ghrelin对甲状腺髓样癌细胞增殖的影响:采用细胞培养方法,观察Ghrelin、LY294002、Ghrelin+LY294002、雷帕霉素、Ghrelin+雷帕霉素、PD98059、Ghrelin+PD98059对TT细胞增殖的影响。(2)GHSR表达下调对Ghrelin促TT细胞增殖的影响:采用细胞培养方法,观察转染GHSR siRNA对Ghrelin促TT细胞增殖效应的影响。(3)Ghrelin促细胞增殖效应与细胞增殖相关信号通路的研究:采用Western Blot方法,观察细胞蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白的表达。2.在体研究:(1)TT细胞移植瘤接种:4-5周龄雄性BALB/c裸小鼠,右背部皮下注射TT细胞(5×10~6个/100μl PBS),注射后每5天测量1次肿瘤大小。(2)Ghrelin对TT细胞移植瘤生长的影响:小鼠皮下注射TT细胞,20天后瘤组织内注射5μg GHSR siRNA/50μl、5μg siRNA/50μl、5 nM Ghrelin/50μl、(5μg GHSR siRNA+5 nM Ghrelin)/50μl(注射5μg GHSR siRNA,24 h后注射5 nM Ghrelin)或(5μg siRNA+5 nM Ghrelin)/50μl(注射5μg siRNA,24 h后注射5nM Ghrelin),对照组仅注射50μl NS。药物每5天注射1次,共注射4次(20天)。实验结束后,处死小鼠,取肿瘤组织,测量体积并称重。同时取肿瘤组织行Western blott研究,观察Ghrelin及GHSR siRNA对移植瘤组织AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响。结果1.Ghrelin促甲状腺髓样癌细胞增殖及机制研究(体外实验)(1)Ghrelin对甲状腺髓样癌细胞增殖影响结果显示:培养液中滴加不同浓度的Ghrelin(0.1 nM,1 nM,5 nM,10 nM)/0.1mL,72 h后TT细胞显著增多,且呈剂量依赖性增加(P<0.05～0.01),其中5 nM Ghrelin效应最大,故在后续研究中采用5 nM作为Ghrelin的研究剂量。(2)GHSR下调对Ghrelin促TT细胞增殖影响结果显示:TT细胞转染GHSRsiRNA,24 h后TT细胞GHSR蛋白表达显著降低(P<0.05);此时培养液中滴加Ghrelin,与siRNA+Ghrelin组比较,Ghrelin促TT细胞增殖效应明显减弱(P<0.05)。但细胞预先用siRNA孵育,不能显著改变Ghrelin促细胞增值效应(P>0.05)。单独滴加siRNA对TT细胞增殖无显著改变(P>0.05)。(3)LY294002对Ghrelin诱导TT细胞增殖效应的影响结果显示:因PI3K/AKT信号通路在细胞生长、增殖以及迁移中具有重要作用,本研究预先在TT细胞培养液中滴加PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002,则Ghrelin促TT细胞增殖效应可被部分阻断(P<0.05);若单独给予LY294002,TT细胞增殖无显著改变(P>0.05)。(4)雷帕霉素对Ghrelin诱导TT细胞增殖效应的影响研究显示:作为PI3K/AKT信号通路的下游效应器mTOR,在多种癌细胞的增殖中具重要意义。TT细胞预先滴加mTOR抑制剂雷帕霉素,Ghrelin促TT细胞增殖效应可被部分阻断(P<0.05);若单独给予雷帕霉素,TT细胞增殖无显著改变(P>0.05)。(5)PD98059对Ghrelin诱导TT细胞增殖效应的影响研究显示:RAS/RAF/ERK信号通路是另一条参与调控细胞生长、增殖以及迁移的重要通路。预先滴加ERK1/2信号通路抑制剂PD98059,可使Ghrelin促TT细胞增殖效应被部分抑制(P<0.05);若单独滴加PD98059,TT细胞增殖无显著影响(P>0.05)。统计学分析进一步显示,LY294002、雷帕霉素或PD98059对Ghrelin促TT细胞增殖的抑制效应无显著差异(P>0.05)。(6)Ghrelin对TT细胞PI3K/AKT/mTOR或RAS/RAF/ERK信号通路激活的影响研究显示:TT细胞培养液滴加Ghrelin,72 h后细胞内p-AKT、p-ERK1/2、p-PI3K和p-mTOR蛋白表达则显著升高(P<0.05)。2.Ghrelin促TT细胞移植瘤生长及潜在机制研究(体内实验)(1)GHSR siRNA对TT细胞移植瘤GHSR蛋白表达的影响结果显示:移植瘤内注射GHSR siRNA可使肿瘤细胞GHSR蛋白表达显著降低(P<0.05)。但移植瘤内注射siRNA对GHSR蛋白表达无显著影响(P>0.05)。(2)Ghrelin对TT细胞移植瘤生长的影响结果显示:移植瘤内注射Ghrelin可使移植瘤体积显著增大(P<0.05),瘤重显著增加(P<0.05);若瘤内预先注射GHSR siRNA,ghrelin促肿瘤生长作用可被减弱,表现为肿瘤体积显著减小(P<0.05),瘤重显著降低(P<0.05)。(3)Ghrelin对TT细胞移植瘤生长相关信号通路蛋白表达的影响结果显示:移植瘤内注射Ghrelin,瘤组织中p-AKT(P<0.05)、p-ERK1/2(P<0.05)、p-PI3K(P<0.05)或-mTOR(P<0.05)蛋白及其mRNA表达显著升高。进一步研究显示,移植瘤内预先注射GHSR siRNA,可使Ghrelin促p-AKT(P<0.05)、p-ERK1/2(P<0.05)、p-PI3K(P<0.05)和p-mTOR(P<0.05)蛋白表达作用显著减弱。本实验还发现,移植瘤内注射GHSR siRNA,可使瘤体积显著减小(P<0.05),瘤重显著降低(P<0.05);且p-AKT(P<0.05)、p-ERK1/2(P<0.05)、p-PI3K(P<0.05)和p-mTOR(P<0.05)蛋白表达也显著降低。结论Ghrelin可通过激活GHSR信号通路促进肿瘤细胞增殖,且PI3K/AKT/mTOR信号通路和ERK1/2信号通路可能也参与Ghrelin促肿瘤增殖效应调控。