本文主要从以下几个部分进行论述：　　第一部分 活性氧激活的NLRP3炎症小体在小鼠干眼发病中的机制研究　　目的:研究活性氧(ROS)在小鼠环境诱导型干眼发病过程中的作用，并确定ROS是否通过激活NLRP3炎症小体来介导干眼炎症反应。　　方法:研究采用本课题组开发的智能控制环境系统(ICES)创建小鼠干眼模型，在这个系统中相对湿度、空气流速和温度分别维持在15.3±3％，2.1±0.2m/s和21-23℃。将C57BL/6系雌性小鼠（4-6周龄）置于ICES系统中1周、2周以诱导干眼，并予配置的0.3％ N-acetyl-L-cysteine(NAC，ROS抑制剂)眼水局部点眼，观察其对干眼形成的抑制效果。实验分为5组:1）置于正常环境并无干预措施的正常对照组;2）置于ICES中1周组;3）置于ICES中2周组;4）置于ICES中并同时双眼予0.3％ NAC眼水点眼2周组;5）置于ICES中并同时双眼予生理盐水(NS)点眼2周组。在实验第0、1、2周进行所有实验动物的临床眼表评估（角膜荧光染色评分），后分别取各组小鼠角膜、结膜组织或完整眼球。ROS试剂盒检测组织中ROS水平，应用Real Time-PCR、免疫荧光共聚焦显微镜、ELISA等方法检测评估角膜、结膜组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β表达情况，并用荧光试剂盒检测Caspase-1的活性程度。　　结果:小鼠角膜荧光素钠染色评分随ICES时间延长逐渐增加，ICES1周时点染有少量增加，但ICES2周点染显著多于正常对照组和ICES1周组。ROS在小鼠角膜、结膜中的表达在ICES1周开始即有明显的持续性增多。Real Time-PCR结果示角膜、结膜组织NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β的基因表达在ICES1周时与正常对照组无差异，但在ICES2周时表达显著升高;免疫荧光共聚焦显微镜半定量检测NLRP3、Caspase-1、和IL-1β的蛋白表达水平与基因表达情况一致。Caspase-1活性在ICES1周时与正常对照组无差异，但ICES2周时明显增强。ROS抑制剂NAC眼水点眼2周后小鼠角膜荧光素钠染色显著下降，接近正常水平;其角膜、结膜中的ROS表达也明显降低，同时NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β的基因和蛋白表达量及Caspase-1的活性，均明显低于NS对照组。　　结论:ROS的过表达参与环境诱导性干眼的发病，其通过激活NLRP3炎症小体从而介导干眼炎症介质IL-1β的过表达。ROS-NLRP3-IL-1β这一事件轴的激活可能是环境诱导性干眼的启动程序。　　第二部分 高渗刺激的人角膜上皮细胞NLRP3炎症小体作用的机制研究　　目的:以高渗刺激下的人角膜上皮细胞株(HCECs)为对象，研究ROS、胞内受体NLRP3及炎症因子IL-1β在RO S-NLRP3-IL-1β信号通路中的各自地位和作用。　　方法:首先检测不同程度高渗透压刺激后HCECs中ROS及NLRP3炎症小体各聚合成分（NLRP3、ASC和Caspase-1）和IL-1β的mRNA的相对表达量的变化趋势，并选择出最佳高渗透压进行后续实验。第二，以310 mOsm为等渗对照组、500 mOsm为高渗对照组，比较予ROS抑制剂NAC20mM预处理的HCECs对500 mOsm高渗刺激的反应。用ROS探针氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯检测细胞中ROS水平，Real-time PCR检测NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表达量，Western blot检测NLRP3的蛋白表达，并分别用荧光试剂盒和ELISA定量检测细胞中Caspase-1的活性程度和细胞培养上清液中活性IL-1β的含量。第三，设计合成靶向人NLRP3的干扰RNA，转染至HCECs后再予500 mOsm高渗刺激，设等渗、高渗对照组和阴性转染对照组，同样方法检测细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表达、NLRP3的蛋白表达，及Caspase-1的活性程度和细胞培养上清液中活性IL-1β的含量。　　结果:HCECs中ROS水平及NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达在高渗透压到一定程度后（500 mOsm以上）才出现明显的升高，500 mOsm对本细胞株是较佳的刺激程度。NAC预处理的HCECs对500 mOsm高渗刺激反应下调，与高渗对照组相比，其细胞内ROS被基本清除，NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达下降，同时NLRP3的蛋白表达也降低，Caspase-1活性减弱，细胞培养上清液中活性IL-1β的含量下降。成功转染NLRP3干扰RNA后的HCECs中NLRP3基因表达被抑制，对500 mOsm高渗刺激无明显反应，与转染阴性对照组相比，其NLRP3炎症小体各成分的mRNA表达降低，Caspase-1活性减弱，分泌的活性IL-1β也减少。　　结论:高渗刺激的HCECs，首先使ROS的生成迅速增多，ROS再激活NLRP3炎症小体使其分泌过量的活性IL-1β，这个过程中ROS、NLRP3和IL-1β存在有序性信号传导，提示RO S-NLRP3-IL-1β信号通路对启动干眼炎症反应的重要启动作用。　　第三部分 ROS-NLRP3-I L-1β信号通路在外环境性干眼患者中的初步验证　　目的:研究临床外环境性干眼患者结膜上皮细胞和泪液样本中ROS、模式识别受体NLRP3及炎症因子IL-1β相对于正常人的表达差异，以验证ROS-NLRP3-1L-1β信号通路是否参与临床干眼的发病过程。　　方法:实验对象为单纯由低湿度、高风速环境，或职业环境因素如过长时间的视频终端仪器(VDT)的使用引起的临床外环境性干眼患者，并且符合眼表自觉症状OSDI(Ocular Surface Disorder Index)评分＞20分且泪膜破裂时间(TBUT)＜5s，入选符合标准的干眼患者20例和正常对照组15例。结膜印迹细胞法取结膜上皮细胞，高速离心法收集Schirmer试纸中的泪液，用ROS探针二氯二氢荧光素二乙酯检测结膜上皮细胞中ROS水平，Real-time PCR检测其NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表达量，并用ELISA试剂盒定量检测泪液中活性IL-1β的含量。　　结果:外环境性干眼病人组中男性7例，女性13例，年龄为33.5±7.3岁;正常组男性5例，女性10例，年龄为30.3±6.5岁，两组间性别比及年龄均无统计学差异。干眼组OSDI分值36.35±10.70，正常组为3.45±2.05，两组差异显著(P＜0.001);干眼组TBUT为3.13±1.22s，明显低于正常组的11.93±1.39s(P＜0.001);SchirmerⅠ试验在干眼组为7.13±3.63mm/5 min，也明显小于正常组的12.6±2.52mm/5min(P＜0.001)。干眼组结膜上皮细胞中ROS水平，NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA水平及泪液中活性IL-1β的含量都显著高于正常组(P≤0.023)。且干眼组泪液样本中的活性IL-1β水平与OSDI分值呈正相关（R2=0.402，P=0.003），与TBUT成负相关(R2=0.306，P=0.011)，而与SchiraierⅠ试验相关性不明显。　　结论:ROS在外环境性干眼病人结膜上皮细胞中生成过度、NLRP3及NLRP3炎症小体组成成分表达上调，且泪液中活性IL-1β的表达升高，三者在干眼病人中的联合性表达上调，验证RO S-NLRP3-IL-1β信号通路与外环境性干眼的早期发病密切相关。