特发性肺纤维化（Idiopathicpulmonary fibrosis,IPF）是一种进展性的肺间质疾病,其病理特征表现为肺成纤维细胞异常活化、增殖并逐渐介导肺间质基质的过度累积、肺组织过度瘢痕化、正常肺泡结构遭到进行性的破坏,最终致使患者肺部气体交换受损甚至肺功能丧失,从而导致呼吸衰竭引起死亡。该病预后较差,死亡率高,确诊后患者的中位生存期仅为3～5年。目前,针对IPF的临床治疗手段,除了能够逆转IPF的肺移植术之外,无论是药物治疗还是以肺康复训练为主的非药物治疗,都只是减缓肺纤维化的进展,而缺乏逆转已经形成的纤维化病灶的能力,但肺移植术中存在的肺源短缺和昂贵花费等实际问题决定了其极大的治疗局限性。因此,一种有前景的治疗策略迫切需要被开发来实现纤维化病灶的恢复,患者肺功能的提升及患者生存期的有效延长。尽管IPF的致病因素和机制未被完全地掌握,但是近期研究表明,反复遭受损伤性刺激会导致肺泡上皮功能异常,伤口愈合反应过度,肌成纤维细胞过度活化,细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过量沉积,因此,IPF被认为是一种以肺泡上皮损伤、Ⅱ型肺泡上皮细胞大量减少或肺泡干细胞衰竭、肺泡塌陷等为特征的疾病。近年来,围绕缓解IPF的国内外研究中,间充质干细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞等代表的细胞疗法、二甲双胍代表的代谢调节疗法、抗促纤维化的转化生长因子 β1（Transforming growth factor beta 1,TGF-β1）作用的全过程（合成、活化及与受体的结合）、促进ECM降解的疗法、抗纤维化的细胞因子疗法、激素疗法等均被提出以降低纤维化的负荷,但是部分研究存在其主要靶点是疾病的进展而非病灶的恢复,或者治疗药物的靶向性不高、毒副作用较大等不足。鉴于肺纤维化疾病中致使患者呼吸衰竭的主要病理因素是细胞外间质过度累积并不断侵袭破坏肺泡,因此促使形成瘢痕的ECM降解以恢复肺泡及其与血管间的气体交换空间,并促进肺泡上皮重塑的联合治疗在理论上可介导纤维化病灶的恢复,提升患者的肺功能。基于此,本课题提出了针对IPF的治疗机制——消融与重构相结合。（1）消融ECM方面:基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）几乎可以降解ECM中的所有胶原蛋白成分,但是研究表明部分MMPs具有促纤维化的作用,比如MMP2在纤维化病灶中高表达,可以破坏肺泡上皮基底膜,有助于瘢痕侵袭肺泡。而MMP13是一种主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的胶原酶,不会破坏肺泡上皮基底膜,并且已有研究证明其具有抗纤维化作用,故将MMP13作为促进肺泡内沉积瘢痕消融的递送药物。本课题选择采用mRNA形式递送MMP13,其相比DNA药物和蛋白质药物具有安全、可控等优势。但是在mRNA递送方面必须要考虑几个关键问题:如何避免核酸酶对mRNA的降解?如何促使mRNA被高效摄取入靶细胞?如何促使mRNA在细胞内逃逸内吞/溶酶体并翻译出目的蛋白?为解决以上关键问题,本课题首次提出并利用了一种内源性的阳离子核糖体蛋白作为压缩mRNA的载体,进一步在mRNA-核糖体蛋白复合物的表面包覆一层溶酶体pH条件下可实现电荷翻转促进逃逸的聚合物来递送MMP13 mRNA（mMMP13）。（2）重构肺泡方面:研究表明IPF中肺远端上皮干细胞大量缺失,需要促增殖的细胞因子促进其重生。角化细胞生长因子（Keratinocytegrowth factor,KGF）,可以特异性地促进上皮细胞增殖,但不促进成纤维细胞增殖。已有研究证明使KGF过表达或者气管内滴注KGF能够预防或减轻博来霉素诱导的肺纤维化。重组人KGF已被作为药物批准使用治疗化疗后的严重黏膜炎性疾病。因此,本课题选用KGF来重构肺泡上皮,但是KGF对正常肺泡中的上皮干细胞同样具有促增生作用,非靶向给药存在一定的副作用,甚至具有致癌的风险。为降低这一潜在的副作用,本课题设计将KGF响应纤维化病灶内过度表达的MMP2而释放,使其仅在病灶处起效。本课题主要研究内容和结果如下:1.共载KGF和mMMP13纳米复合物（mMMP13@RPL32/P-KGF）的制备及表征本课题首先制备了纳米复合物外层修饰的可在内吞/溶酶体pH条件下实现电荷翻转的聚L-赖氨酸衍生聚合物。通过静电相互作用将经预先筛选的最佳60S核糖体蛋白 L32（60s ribosomal protein L32,RPL32）与 mMMP13 在最佳质量比（RPL32:mMMP13=8）下制备成mMMP13@RPL32复合物,而后修饰上顺式乌头酸和双功能肽接枝的聚L-赖氨酸衍生聚合物（P）。将一定量的KGF接枝在纳米复合物的表面,同时接枝适量的mPEG来缓冲雾化过程中KGF所受到的剪切力等,从而制备出供吸入治疗用的mMMP13@RPL32/P-KGF纳米复合物。通过粒径电位测定仪和透射电镜对纳米复合物进行理化表征,结果显示mMMP13@RPL32/P-KGF纳米复合物在压缩雾化前后的形态和粒径电位变化（雾化前:261.6±2.558nm、-3.63±0.26mV;雾化后:251.2±5.093 nm、-3.23±0.46 mV）均不显著,且在与MMP2孵育24 h后及其在pH 5.5条件下均显示出一定的形态变化。体外KGF释放实验结果显示,KGF在50 nM MMP2条件下24 h内的累积释放率（67.2%）相比于25 nM MMP2条件下24 h内的累积释放率（43.1%）更佳,表明纳米复合物具有良好的MMP2响应释放KGF的能力。2.雾化后mMMP13@RPL32/P-KGF纳米复合物的体外递送及安全性评价以人源Ⅱ型肺泡上皮细胞（AEC2）为细胞模型,通过细胞毒性实验、促增殖实验分别考察雾化后的mMMP13@RPL32/P-KGF纳米复合物的体外安全性和促上皮再生能力,结果显示该纳米复合物对AEC2无显著性毒性且与MMP2共孵育后对AEC2有显著性的促增殖效果,表明该纳米复合物体外安全性良好、有促上皮再生的潜力。以TGF-β1诱导的肌成纤维细胞和A549细胞为细胞模型,体外细胞摄取实验结果显示,经MMP2预处理的雾化后纳米复合物组相比于未经MMP2处理组显著增强了 mRNA的胞内摄取信号（p＜0.0001）,并且6 h组的mRNA的胞内摄取信号均强于3 h组和1 h组,表明构建的纳米复合物能够在RGD-整合素的作用下被良好地摄入细胞内。体外内吞/溶酶体逃逸实验结果显示相比于给药1 h组的mRNA信号,给药6 h组中逃逸内吞/溶酶体的mRNA信号明显增多。以增强型绿色荧光蛋白mRNA（mEGFP）为工具mRNA研究该递送系统的体外递送效率,共聚焦显微镜下观察结果和流式细胞术测定结果均显示雾化后的纳米复合物经MMP2预处理后可以良好地递送mRNA,递送效率在65%左右。ELISA结果显示体外递送mMMP13能够翻译出MMP13,并且蛋白量在48 h内保持升高趋势。3.mMMP13@RPL32/P-KGF纳米复合物的体内药效及安全性评价采用博来霉素气管内滴注诱导的C57BL/6J雄性肺纤维化小鼠作为动物模型进行体内的相关评价。体内分布结果中,以mFluc构建的纳米复合物经雾化吸入后仅在小鼠肺部显示出信号。体内安全性评价中的苏木精伊红（Hematoxylin and eosin,H＆E）组织染色结果显示,构建的纳米递送系统对肺纤维化小鼠的心、肝、脾、肾器官无明显毒性。药效学评价中,组织染色（H＆E染色、Masson染色、天狼星红染色和α-SMA染色）、组织羟脯氨酸含量和western blot结果表明mMMP13@RPL32/P-KGF纳米复合物可以显著缓解小鼠肺纤维化;通过免疫荧光染色对各组肺组织中的Ⅰ型肺泡上皮细胞标志物——水通道蛋白5（Aquaporin 5,AQP5）和Ⅱ型肺泡上皮细胞标志物——表面活性蛋白C（Surfactant protein C,SP-C）进行染色,结果表明mMMP13@RPL32/P-KGF纳米复合物有助于保护或重生肺泡上皮。肺功能测试中,各指标结果表明mMMP1 3@RPL32/P-KGF纳米复合物有助于保护或提升博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺功能。各治疗组模型小鼠生存期统计实验中,相比于PBS治疗组,mMMP13@RPL32/P-KGF纳米复合物组能够显著延长小鼠的生存期。综上,基于消融与重构的协同治疗思路,本课题提出了 mMMP13和KGF联合递送策略,本研究以重组核糖体蛋白为载体,通过双重功能化修饰制备了共载mMMP13和KGF的纳米递送系统。该系统具有优良的生物相容性和药物递释能力,雾化吸入后微滴携带的纳米制剂沉积于肺泡中,在病灶部位响应释放外层KGF,促进肺泡上皮细胞增殖;mMMP 13重组核糖体蛋白复合物被摄取后,原位产生MMP13加速肺泡腔中细胞外基质降解,促进纤维化病灶修复。小动物实验显示该系统可降低小鼠肺组织纤维化水平、协同恢复肺泡完整性,改善博来霉素诱导的IPF小鼠模型肺功能。