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随着基因组测序的完成、大规模BAC库的构建和EST测序工作的进一步深入,稻瘟菌的分子信息数据越来越丰富。但迄今为止,关于稻瘟菌基因和蛋白质序列的功能,大部分都是假定的,缺乏实验证据,因此用实验证据诠释稻瘟菌功能基因组学显得更为迫切。 本研究使用所在实验室已经建立的遗传转化体系,利用农杆菌菌株AGL-1介导T-DNA转化法转化稻瘟菌菌株Y34,使T-DNA插入突变体数目达到6855个。转化率约为每1.0×10~6个分生孢子获得300个转化子。取最先获得的1600个转化子在感瘟病水稻品种日本晴(Nipponbare)和抗瘟病品种C101上进行致病性测定。将初筛获得的致病力发生变化的转化子进行第二次和第三次接种。结果从1600个转化子中获得49个致病相关突变体,其中病害级别从原来对日本晴的正常致病下降到完全不能致病的有23个,占参试转化子的1.44%,病害级别下降到1-3级的有26个,占1.62%。 从49个致病相关突变体中取25个分别进行菌落形态、产孢量、分生孢子萌发和附着胞形成能力的观察和测定,结果获得一些菌落形态和产生分生孢子能力异常的突变体。对这25个突变体进行PCR扩增,结果全部都扩增到潮霉素磷酸转移酶(hph)基因序列。 以T-DNA右边界序列设计的嵌套引物RB(RB1、RB2、RB3)和随机引物AD4为引物组合,对致病相关突变体的T-DNA插入位点的右侧翼进行TAIL-PCR扩增。结果从10个致病相关突变体的基因组DNA上扩增到13条特异条带,其中有3个突变体各自扩增到2条特异条带,其余7个突变体各扩增到1个特异条带。对这些特异条带进行克隆并测序,结果有9个克隆测序成功,有4个克隆由于出现二级结构或者杂峰而测序失败。在测序成功的克隆中,4个克隆为pCAMBIA1300载体序列,5个克隆为TAIL-PCR扩增产物。将这5个克隆的测序结果与稻瘟菌基因组进行比较,得到相应的致病相关突变体T-DNA插入为点的侧翼序列信息。具体如下: 突变体Y34-0195中T-DNA的整合位点在稻瘟菌Ⅵ号染色体重叠群2.35上1744bp处,位于未知蛋白的编码基因MG00143.4上游2000bp内部;突变体Y34-0173中T-DNA插在稻瘟病菌Ⅰ号染色体重叠群2.289的4829bp处,位于预测基因