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研究背景:子宫颈癌占女性恶性肿瘤的第二位,仅次于乳腺癌,该病的发病呈年轻化和上升化趋势。每年大约有500,000名妇女被诊断为侵袭性子宫颈癌,80%来自于发展中国家,而且有一半患者死于此病。手术治疗目前已被认为是早期子宫颈癌的首选方法,但是对于后期、复发及远处转移的患者,手术治疗的效果是很差的。另外,此期的患者通常对化学药物治疗是耐药的,而且大多此期的患者本身的体质很差,也很难耐受化疗和放疗,所以大多数患者都死于无法控制。因此,寻找一种新的低副作用的治疗子宫颈癌的方法是必要的。组蛋白去乙酰化酶抑制剂( Histone deacetylase inhibitor,HDACi)对人类多种肿瘤具有潜在的抗肿瘤治疗作用,因为其具有诱导肿瘤细胞分化、细胞周期阻滞及细胞凋亡作用。丙戊酸钠(Valproic acid,VPA)作为一种抗精神病药物而被用来治疗癫痫和情绪失控,在此治疗浓度范围内作为HDACi时仅产生轻微的副作用,甚至当血清浓度超过正常治疗范围时也是如此。据报道,在子宫颈癌中组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)是过表达的,而且从子宫颈细胞涂片中组蛋白H3的磷酸化和乙酰化水平也表明,组蛋白H3的修饰与子宫颈癌疾病进程从宫颈上皮内瘤样病变(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CINⅠ)到CINⅡ再到CINⅢ之间有明显的相关性。因此HDACs被认为是治疗子宫颈癌的一个靶点。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid, ATRA)一种具有调节细胞生长和分化得药物,其同时具有调控正常上皮细胞分化。目前的临床实验已表明,ATRA在子宫颈癌和癌前病变中具有化疗和诱导化疗的作用。ATRA的作用通路是由RA受体介导的。在所有的RA受体中,RARβ(尤其RARβ2)被认为起主要的肿瘤抑制作用,而且它的缺失和肿瘤的进展有关。RARβ2的低表达在多种肿瘤中可见,包括肺癌、乳腺癌、头颈部癌和子宫颈癌。肿瘤细胞中此种受体的缺失和其基因启动子区组蛋白的超甲基化和去乙酰化有关。因此,HDAC抑制剂联合ATRA可能会恢复沉默的RARβ2的表达,进而可在多种肿瘤中发挥ATRA的诱导细胞生长抑制及促凋亡作用。目的研究VPA联合ATRA对宫颈癌HeLa及SiHa细胞株的生长抑制作用,并探讨其分子机制,为子宫颈癌的治疗提供理论依据和治疗线索。方法1.体外实验:采用3mM VPA、1μM ATRA、1μg/mL顺铂(diammine dichloroplatinum DDP)单独和联合作用于子宫颈癌HeLa及SiHa细胞,对照组仅加溶媒;(1)采用MTT法检测药物处理后子宫颈癌HeLa及SiHa细胞生长抑制率(2)采用免疫组织化学SP法检测药物处理后子宫颈癌HeLa及SiHa细胞中Ki67的表达差异。(3)采用Western-blot方法检测药物处理后子宫颈癌HeLa及SiHa细胞中AC-H3、RARβ2、p53、STAT3、p-STAT3、p21及cyclinD1的表达差异。(4)采用流式细胞术(FCM)检测药物处理后子宫颈癌HeLa及SiHa细胞的周期。2.体内实验:将生长状态良好的HeLa及SiHa细胞接种到CD1 nu/nu裸鼠左侧肩胛部皮下,每只裸鼠接种细胞5×10~6个,待成瘤后,分别给与VPA采取腹腔注射终浓度为(300mg/kg/d),ATRA( 15mg/kg/d)采取灌胃方法DDP采取尾静脉注射终浓度为(2mg/kg),每周2次,对照组给予生理盐水。治疗时间为4周。(1)每2天用游标卡尺测量肿瘤大小,按照公式:肿瘤体积=(长×宽~2)/2计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。(2) 28d后处死动物,并将肿瘤组织剥离提取总蛋白,Western-blot方法检测AC-H3、RARβ2、p53及p-STAT3及其下游基因的表达情况(3)采用免疫组织化学SP法检测裸鼠瘤组织中Ki67的表达变化结果:1.体外实验:(1) MTT实验结果发现VPA联合ATRA对细胞有显著的增殖抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)免疫组织化学结果发现VPA联合ATRA可降低细胞中Ki67的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。(3) Western-blot结果显示,VPA联合ATRA显著提高子宫颈癌HeLa及SiHa细胞中AC-H3、RARβ2、p53及p21表达,降低STAT3、p-STAT3及cyclinD1蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。(4) FCM结果发现,VPA联合ATRA可使子宫颈癌HeLa及SiHa细胞周期阻滞于G1期,差异有统计学意义(P<0.05)。2.体内实验:(1) VPA联合ATRA显著抑制裸鼠瘤生长,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与DDP组比较无统计学意义(P>0.05)。(2) Western-blot结果显示,VPA联合ATRA显著提高裸鼠瘤组织中AC-H3、RARβ2、p53及p21表达,降低STAT3、p-STAT3及cyclinD1蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)免疫组织化学结果发现VPA联合ATRA可降低裸鼠瘤组织中Ki67的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论(VPA)联合(ATRA)可抑制子宫颈癌HeLa及SiHa细胞的增殖并诱导其细胞周期阻滞,AC-H3、RARβ2、p53表达的上调及p-STAT3表达的下调可能为其机制之一。