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水稻是世界上最重要的粮食作物之一,全球近半数人以稻米为食,一直以来,虫害是造成水稻减产的主要原因之一。稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis),俗称卷叶虫,属于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae),是对水稻危害最为严重的主要害虫之一。海藻糖酶是昆虫体内海藻糖代谢的一个关键酶,在昆虫发育和能量调节中具有重要作用,是害虫控制的理想靶标。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象。本研究的主要目的是利用转基因RNAi技术,获得对稻纵卷叶螟海藻糖酶基因具有沉默作用的转基因水稻植株,为稻纵卷叶螟的生物防治奠定基础。主要研究结果如下:1.稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达谱采用RACE-PCR方法从稻纵卷叶螟中克隆得到可溶型海藻糖酶基因(Cm Tre1)的全长c DNA,其长度为2364 bp,开放阅读框长1704 bp,编码567个氨基酸。生物信息学分析显示该酶前端有16个氨基酸的信号肽,但无跨膜结构域,等电点为5.32。同源建模预测显示,Cm Tre1的三维分子结构中含18个α螺旋,2个β折叠片。同源性分析表明Cm Tre1与竹蠹螟(Omphisa fuscidentalis)的可溶型海藻糖酶相似性最高,为74%;与红带袖蝶和帝王蝶的可溶型海藻糖酶的相似性分别为67%和66%。基因表达谱分析表明,Cm Tre1在稻纵卷叶螟不同发育时期均有表达,蛹中的表达量最低,成虫中表达量最高;Cm Tre1在检测的成虫组织中都有表达,其表达水平从高到低为:中肠>表皮>马氏管>头>卵巢>脂肪体>肌肉>精巢。2.重组RNA干扰表达载体的构建与鉴定以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因(Cm Tre1)为靶标,设计RNAi靶位点并将其命名为Cm Tre1*,分别在两端添加Bam H I和Spe I酶切位点并进行人工合成,经双酶切后与植物表达载体p1301连接,构建p1301-Cm Tre1*重组表达载体。PCR、双酶切及测序鉴定结果表明重组表达载体p1301-Cm Tre1*构建成功,并将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。3.转基因水稻的获得及RNA干扰效应检测用含有p1301-Cm Tre1*质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号水稻的愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,获得74株转基因再生植株。GUS染色及靶标位点的PCR和RT-PCR检测结果表明,26株是含有Cm Tre1*的阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照,用实时荧光定量PCR方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因的m RNA表达水平,并检测其体内海藻糖酶活性变化。结果显示,相较于对照组,取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因表达量下降了44.79%,海藻糖酶活力平均下降了14.94%。研究结果表明转基因水稻的RNA干扰效应相当明显,能对取食其叶片的稻纵卷叶螟CmTre1基因起到明显的沉默作用。