肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC,简称肝癌)是临床常见病、多发病和我国城乡居民死亡的主要原因。大多数患者确诊时已为中晚期,失去了手术治疗的时机,只能选择非手术治疗。然而,肝癌对常规化疗药物不敏感,易发生抗药、耐药,但机制至今不完全清楚,导致复发率高、预后很差,严重危害着人民的身体健康。近年来,探讨细胞自噬的本质,尤其自噬与肝癌的关系成为亟待求证的重要命题,为肝癌的发病机制和诊治研究注入了新内容。本研究采用分子生物学、细胞生物学、实验动物学等技术,从药理学研究角度,对自噬在EGCG治疗肝癌中的作用进行了研究。第一部分肝癌细胞发生自噬的特征及其对化疗药物作用影响的研究目的研究肝癌细胞发生自噬的形态特征及分子特征；探讨肝癌自噬是否参与肝癌化疗药物的作用过程及意义。方法以传代培养的肝癌细胞株Hep3B、HepG2细胞为研究对象。在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液常规培养基础上,按不同实验加入不同浓度的阿霉素孵育。通过透射电镜观察药物作用后肝癌细胞内自噬形态。通过细胞免疫荧光检测肝癌细胞LC3的表达。用Western blot检测阿霉素对肝癌细胞内自噬蛋白Beclinl、Atg5表达的影响。MTT法分析不同浓度阿霉素对Hep3B、HepG2两种肝癌细胞增殖抑制的作用。采用自噬抑制剂3-MA对细胞进行预处理后,台盼蓝染色观察自噬对阿霉素所诱导肝癌细胞死亡的影响。结果(1)在透射电镜下,肝癌细胞可见到吞噬泡、自噬体和自噬溶酶体三个不同阶段自噬现象的发生；阿霉素作用下,肝癌细胞胞浆见较多中毒空泡,典型的自噬体和自噬溶酶体数量增多。(2)荧光显微镜下,发现阿霉素诱导肝癌细胞自噬体膜标志性LC3蛋白质表达增加。(3)Western blot检测到自噬标志分子Atg5、Beclinl等呈现阿霉素浓度依赖性表达上升。(4)用0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μM梯度浓度的阿霉素作用于Hep3B细胞,用0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM梯度浓度的阿霉素作用于HepG2细胞,48h后行MTT检测,显示阿霉素可浓度依赖性抑制这两种肝癌细胞的生长。其中,阿霉素对Hep3B的IC50为4.06μM,HepG2的IC50为0.60μM。(5)台盼蓝染色结果显示,2.5μM阿霉素作用Hep3B 48h后,细胞死亡率为(9.76±1.3)%；与之相比,经3MA预处理后再加入阿霉素作用,细胞的死亡率增至(14.15±4.64)%(P<0.01)。对HepG2细胞,0.5μM阿霉素作用48h的细胞死亡率为8.91±2.87%,经3MA预处理后的阿霉素所致细胞死亡率增至18.00±4.57%(P<0.01)。结论阿霉素抑制肝癌细胞增殖同时可诱导自噬信号的增强；所诱导的自噬变化可能是肝癌细胞对抗该药物杀伤作用的自我保护机制。第二部分表没食子儿茶素没食子酸酯对肝癌细胞自噬的影响目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对肝癌Hep3B细胞自噬和细胞增殖水平的影响。方法DMEM培养基常规培养Hep3B细胞,分组给予不同浓度和不同时长EGCG作用。通过透射电镜观察EGCG对细胞自噬泡形成的影响；实时定量逆转录PCR及免疫印迹检测自噬相关基因及蛋白分子表达；通过MTT法检测细胞增殖抑制率,计算IC50。结果EGCG作用于Hep3B细胞后,细胞内自噬泡的形成明显减少,自噬相关基因Beclinl和Atg5的表达下降。Hep3B细胞增殖抑制率与EGCG作用浓度(r=0.925,P<0.05)及作用时长均呈正相关(24、48和72h的相关系数r分别为0.873,0.96,0.978,P<0.05),24h、48h及72h的EGCG作用的IC50分别为(174.77±60.42)u g/mL、(64.72±10.36)u g/mL和(37.49±13.96)μg/mL。自噬相关基因Beclinl和Atg5 mRNA表达水平与EGCG浓度呈负相关(相关系数r分别为-0.923、-0.848；P<0.05),与细胞抑制率呈负相关(r=-0.999、r=-0.990,P<0.01)；Beclinl和Atg5蛋白质水平变化与其mRNA变化趋势一致。结论与常用化疗药物阿霉素诱导自噬水平升高不同,EGCG具有明显下调肝癌Hep3B细胞自噬水平的作用,可能是其抑制肝癌细胞增殖的重要机制。第三部分表没食子儿茶素没食子酸酯与阿霉素联用体外治疗肝癌及自噬机制研究目的评估联用EGCG与阿霉素体外治疗肝癌的协同效果；通过特异性阻断或强化自噬信号,评估自噬机制是否介导这两种药物对肝癌可能的协同治疗作用。方法以体外培养的肝癌细胞株Hep3B为研究对象,通过MTT检测EGCG和阿霉素联合使用对Hep3B细胞增殖的影响,计算两药相互作用系数(Coefficient of drug interaction, CDI)评价两药相互作用性质；流式细胞术检测两药联合对细胞凋亡水平的影响；台盼蓝染色分析EGCG与阿霉素联合对细胞死亡率的影响,在此基础上综合评判EGCG与阿霉素对肝癌是否具有协同治疗作用。通过pEGFP-LC3质粒转染细胞进行自噬信号标识,接着在荧光显微镜下观测EGCG和阿霉素联用对自噬小体形成的影响。与此同时,通过免疫印迹技术分析联用两药下细胞自噬信号分子Beclin、Atg5的表达变化。最后,通过自噬促进剂雷帕霉素(Rapamycin)充分诱导自噬水平或siRNA技术特异性阻断自噬通路,探讨自噬水平与抗癌作用间的因果关系。结果(1)MTT实验显示,不同浓度的EGCG和阿霉素联合对Hep3B的生长抑制率高于同浓度的EGCG和阿霉素单药组,在一定范围内,EGCG和阿霉素联合的CDI值均小于1。(2)台盼兰染色检测显示,2.5μM阿霉素单用细胞死亡率为(10.90±1.0)%(P<0.01)；10μg/mL、20μg/mL两种浓度EGCG分别与2.5μM阿霉素联合后,细胞死亡率明显升高(17.67±1.28%和27.87±1.57%,P<0.01)。(3)流式细胞术结果显示,2.5μM阿霉素所致的Hep3B凋亡率为9.69±0.98%,联合用药后,EGCG能明显增强阿霉素促凋亡作用(17.34±0.92%,P<0.01)。(4)荧光显微镜观测发现,EGCG明显减少阿霉素所诱导增加的胞浆自噬小体数量。(5)Western blot分析自噬分子Beclinl和Atg5的表达,显示EGCG呈抑制自噬作用,而阿霉素为促进自噬作用；与单用阿霉素相比,联用EGCG后可使Beclin、Atg5表达呈下调趋势。(6)经Rapamycin预处理,细胞死亡率由单用阿霉素时的(10.24±1.42)%减至(6.91±1.07)%(P<0.01),而EGCG、阿霉素联用治疗组的死亡率则由(17.46±1.08)%减至(12.41±0.87)%(P<0.01)。(7)经Beclinl-siRNA和Atg5-siRNA干扰后,EGCG、阿霉素联用处理引起的细胞死亡较对照组明显增多,死亡率由14.85±1.17%增加至(22.63±1.14)%和(24.01±0.81)%,(P<0.01),显示此时EGCG和阿霉素的协同抗癌作用进一步增强。结论EGCG和阿霉素联合具有协同抗癌作用,两药联合所促进的Hep3B细胞增殖抑制、凋亡、死亡增加通过抑制自噬信号的机制。从另外角度看,阿霉素诱导的自噬介导着肝癌细胞对该化疗药物产生抗药的过程。第四部分表没食子儿茶素没食子酸酯协同阿霉素治疗肝癌的动物实验研究目的研究同时给予EGCG和阿霉素,是否对肝癌裸鼠模型起协同治疗作用,并进一步探讨其相关的自噬调节机制。方法皮下注射肝癌Hep3B细胞建立荷瘤裸鼠肝癌模型。造模成功后,通过单用EGCG、阿霉素或联合给药等方式分组干预,15天后进行瘤体大体分析及H&E病理组织分析,评判EGCG与阿霉素对肝癌的整体动物治疗效果。与此同时,用免疫组化、免疫印迹法定性、定量分析肝癌组织自噬信号分子的表达；通过TUNEL检测组织切片中药物诱导的肝癌细胞凋亡水平。最后,通过统计学相关分析,探讨联合用药抗癌效应和自噬变化的关系。结果EGCG或阿霉素单用时的抑瘤效应不明显,肿瘤抑制率分别为10.94%和15.73%；EGCG和阿霉素联用时抑瘤作用明显增强,抑制率达36.62%(P<0.05)。H&E染色光镜所见,联合给药时,癌组织坏死区比单药作用时扩大,并见大量淋巴细胞、单核细胞浸润,显示出协同治疗作用。免疫组化、免疫印迹结果显示,阿霉素显著刺激肝癌组织LC3Ⅱ、Beclinl、Atg5、等自噬分子升高,联用EGCG后则明显削弱阿霉素诱导的肝癌组织自噬信号传递,与前面体外研究结果一致。进一步TUNEL分析显示,单用阿霉素的细胞凋亡为(5.27±1.29)%,联用EGCG和阿霉素的细胞凋亡率达(10.47±2.26)%,(P<0.05)。联合用药与肿瘤凋亡率增加呈正相关(OR=2.836,95%CI=1.026-7.839),而与自噬表达呈负相关(OR=0.874,95%CI=0.762-1.003)(P=0.036<0.05)。结论(1)阿霉素抗肝癌同时诱导自噬表达,而EGCG抑癌同时下调自噬水平。两药合用可改变肝癌自噬的表达而促进抑癌、抗癌疗效。(2)EGCG下调肝癌自噬可提高阿霉素的抗癌效果,这为今后联用药物EGCG和阿霉素治疗肝癌提供了新的药理学依据。