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研究背景和目的衰老是机体随年龄增加而发生的所有现象的集中体现。随着时间的推移,衰老将逐渐导致机体功能障碍,最终导致死亡。因此,可以把衰老定义为机体对内、外环境改变发生的年龄依赖性的易损性增加,即机体逐渐减弱了对生理刺激的应答能力。衰老的心脏心功能降低,但其机制仍不清楚。大量研究发现,人类和动物衰老过程中出现大量心肌细胞丢失。由于心肌细胞不能再生,衰老心脏的这种细胞丢失很可能是导致其心功能障碍的机制之一,但这一推测需要更多的研究证实。细胞死亡的主要形式有主动性死亡和被动性死亡。主动性死亡主要包括凋亡,而被动性死亡主要指坏死。由于凋亡是一种基因控制的主动过程,所以抑制凋亡的发生可能比阻止坏死更容易做到。我们及同行的研究证明,阻断细胞凋亡的信号转导过程可以明显改善心功能。生理情况下,凋亡受多种促凋亡分子和抑凋亡分子之间平衡的控制,如果能特异性寻找衰老心脏中激活的促凋亡分子或被破坏的促/抑凋亡分子平衡,并解释其中失衡机制,可能为特异性防止甚至扭转这种细胞丢失提供新的领域。活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）是已知的衰老过程中蛋白修饰和细胞损伤的重要介质。但衰老动物心肌细胞凋亡的增加并不能单一用ROS的产生解释。近年来大量研究资料表明,源于一氧化氮（Nitric Oxide,NO）的活性氮簇（Reactive Nitrogen Species,RNS）也是蛋白修饰和细胞损伤的重要介质。NO由三种一氧化氮合酶（Endothelial NitricOxide Synthase,eNOS;Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS;Neuronal Nitric Oxide Synthase,nNOS）催化L-精氨酸生成。大量研究表明RNS具有抗凋亡和抑凋亡的双重作用,浓度、胞内时空分布、氧化还原状态可能是RNS促进或抑制细胞凋亡的决定因素。生理状态的NO（低浓度的NO）可直接与O2生成NO2,后者再与另一NO反应生成N2O3,N2O3可作为NO+供体,使蛋白质发生S-亚硝基化,后者是NO抗凋亡效应的主要途径;而高浓度的NO（如iNOS催化生成的NO）可以与O2-反应生成极为活跃的过氧亚硝基（ONOO）,,它可以作为NO2+的供体导致蛋白质的硝基化,后者是NO致凋亡效应的主要途径。细胞培养研究证明,衰老的内皮细胞中S-亚硝基化蛋白质含量下降,但衰老心脏心肌细胞的S-亚硝基化蛋白质含量是否下降,以及衰老的心肌细胞凋亡增高的原因是否与其RNS的促凋亡和抑凋亡效应失调有关还未确定。NO不能直接引起蛋白质S-亚硝基化,必需通过NO+供体（N2O3）或NO丢失一个电子产生NO+来参与这一过程。由于N2O3的生成需要2分子的NO,在细胞膜中脂溶性的NO与O2更易聚集而生成NO+供体---N2O3,从而使蛋白质更易发生S-亚硝基化。由于eNOS是唯一与膜相关的NOS,其含量和活性很可能与蛋白质S-亚硝基化密切相关。有研究资料表明,衰老动物及培养的衰老细胞中eNOS的含量和活性下降,但老年大鼠心肌组织中的eNOS表达变化报道不一;此外,eNOS表达水平是否与S-亚硝基化蛋白质含量相关还不清楚。方法（1）分别选取雄性成年（4-6月,n=10）和老年（22-24月,n=16）SD大鼠,设立成年大鼠组与衰老大鼠组,经右侧颈总动脉插管进入左心室,监测心率、左心室压力、左心室压力变化最大速率和心肌收缩指数（Cardiac Index,CI）等心功能指标;（2）分别采用原位末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP NickEnd Labeling,TUNEL）和caspase-3活性测定法检测心肌组织中细胞凋亡发生情况;（3）采用免疫组化方法检测心肌组织中的S-亚硝基化的蛋白质和内皮型-氧化氮合酶（eNOS）的分布及含量;（4）利用NitroGlo试剂盒（PerkinElmer）检测心肌组织中S-亚硝基化的蛋白质表达水平;（5）用Western-blot法检测心肌组织中eNOS和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达;（6）硝基酪氨酸（Nitrotyrosine,NT）是体内生成过氧亚硝基（ONOO-）的标志物,用双抗体夹心酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测NT的表达。结果1.衰老大鼠心功能明显降低1.1心肌收缩功能的指标CI为反映心脏收缩功能的指标之一,与成年大鼠(CI:46.82±3.176 s-1)相比,衰老大鼠的相应指标(CI:39.23±1.62 s-1,P＜0.05)明显下降;1.2心肌舒张功能的指标与成年大鼠反映舒张能力的心功能指标左室舒张压（LeR Ventricular DiastolicPressure,LVDP:-1.16士0.35kPa）和左室舒张末压（Left Ventricular End-DiastolicPressure,LVEDP:-0.70±0.43 kPa）相比,衰老大鼠的相应各项心功能指标（LVDP:0.16士0.17kPa,P＜0.01;LVEDP:1.25±0.35kPa,P＜0.01）明显增高。以上结果提示衰老大鼠的心肌收缩及舒张功能均明显低于成年大鼠。2.衰老大鼠的心脏相对质量明显降低称量成年大鼠（n=8）和衰老大鼠（n=26）的心重及体重并计算其心重/体重比。与成年大鼠心重（0.6l±0.04g）相比,衰老大鼠的心重（1.42±0.04g,P＜0.01）显著增加,但与成年大鼠的心重/体重比（0.31%士0.01%）相比,衰老大鼠的心重/体重比（0.26%4±0.01%,P＜0.01）却显著下降;3.衰老大鼠心肌细胞凋亡增加3.1 TUNEL染色结果TUNEL染色是检测细胞凋亡的一种较灵敏的方法,通过该方法分别对成年大鼠及衰老大鼠心肌组织进行检测、并计数凋亡指数,结果显示,成年大鼠心肌细胞凋亡率为0.86%±0.29%,衰老大鼠达到2.86%±0.43%,二者相比,衰老大鼠心肌细胞凋亡明显增加（P＜0.05）:3.2 Caspase-3活性测定结果Caspase-3是细胞凋亡最后通路的关键蛋白,其活性可以定量反映细胞凋亡发生情况。通过对大鼠心肌组织Caspase-3活性测定的结果表明,与成年大鼠的caspase-3比活性（1.00±0.028）相比,衰老大鼠的caspase-3的比活性（2.21±0.327,P＜0.01）显著增高:3.3衰老大鼠心肌细胞凋亡与心功能的相关性分析3.1.1 Caspase-3活性与心肌收缩功能指标CI呈负相关大鼠心肌组织caspase-3活性与CI呈负相关（r=-0.772,P＜0.01）,,即随着caspase-3活性增高,CI降低.或者说,caspase-3活性越高,大鼠心肌收缩功能越差。我们的结果提示:老年大鼠心肌收缩功能下降可能与其凋亡水平增加有关。3.1.2 Caspase-3活性与心肌舒张功能指标LVDP呈正相关大鼠心肌组织caspase-3活性与LVDP呈正相关（r=0.718,P＜0.01）,即随着caspase-3活性增高,LVDP相应增加,即caspase-3活性越,心肌舒张功能越差。提示:与成年大鼠相比,老年大鼠心肌舒张功能下降可能与其凋亡水平增加有关。4.1衰老大鼠心肌组织硝基酪氨酸含量升高本实验通过双抗体夹心ELISA法检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织的NT的表达含量。结果表明,与成年大鼠的NT（0.858±0.143 ng/ml）相比,衰老大鼠的NT（1.545±0.194 ng/ml,P＜0.05）明显升高,说明衰老大鼠心肌组织中有大量过氧亚硝基产生:4.2心肌组织硝基酪氨酸含量与caspase-3活性呈正相关大鼠心肌组织硝基酪氨酸含量与caspase-3活性呈正相关（r=-0.770,P＜0.01）,即随着硝基酪氨酸含量增高,caspase-3活性相应增加。或者说,心肌组织中硝基酪氨酸含量越高,心肌细胞凋亡水平越高。这一结果提示我们:老年大鼠心肌组织凋亡水平增加可能与其硝基酪氨酸含量增高有关。4.3衰老大鼠心肌组织S-亚硝基化的蛋白质表达降低采用免疫组化法和NitroGlo试剂盒（PerkinElmer）检测成年大鼠（n=6）和衰老大鼠（n=6）心肌组织中S-亚硝基化的蛋白质的分布及表达。与成年大鼠（41208±492）相比,衰老大鼠心肌组织中S-亚硝基化的蛋白质（36472±1239,P＜0.01）显著下降;4.4心肌组织中S-亚硝基化的蛋白质与caspase-3活性呈负相关大鼠心肌组织的S-亚硝基化蛋白质含量与caspase-3活性呈负相关（r=-0.767,P＜0.01）,即随着S-亚硝基化的蛋白质含量降低,caspase-3活性增加。或者说,心肌组织中S-亚硝基化的蛋白质含量越低,心肌细胞凋亡水平越高。提示:老年大鼠心肌组织凋亡水平增加可能与其S-亚硝基化蛋白质的含量降低有关。5.衰老大鼠心肌组织iNOS表达增高,eNOS表达降低5.1衰老大鼠心肌组织iNOS表达升高用Western-blot检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织中iNOS表达水平。与成年大鼠的iNOS（125610±11765）相比,衰老大鼠的心肌组织的iNOS（235485±46070,P＜0.01）显著升高;5.2心肌组织中iNOS表达与硝基酪氨酸含量呈正相关大鼠心肌组织中iNOS表达与硝基酪氨酸含量呈正相关（r=0.600,P＜0.05）,即随着iNOS表达增高,NT相应增加。也可以说,心肌组织中iNOS表达越高,硝基酪氨酸含量越高。提示:老年大鼠心肌组织中硝基酪氨酸含量增高可能与其iNOS表达增加有关。5.3衰老大鼠心肌组织中eNOS表达降低用免疫组化法和Western-blot法检测成年大鼠和衰老大鼠心肌组织中eNOS分布及表达。与成年大鼠（564.1±52.9）相比,衰老大鼠心肌组织中eNOS表达（268.4±57.5,P＜0.05）明显下降。5.4心肌组织中eNOS表达与S-亚硝基化的蛋白质含量呈正相关大鼠心肌组织中eNOS表达与S-亚硝基化蛋白质含量呈正相关（r=0.622,P＜0.05）,即随着eNOS表达下降,S-亚硝基化的蛋白质含量相应降低。或者说,心肌组织中eNOS表达越低,S-亚硝基化蛋白质的含量越低。提示:老年大鼠心肌组织中S-亚硝基化的蛋白质含量降低可能与其eNOS表达下降有关。结论1.衰老大鼠心肌细胞凋亡增加、心脏相对质量下降、心功能明显降低;2.衰老大鼠心肌组织中,具有细胞毒性的ONOO大量生成,而保护心肌细胞的S-亚硝基化的蛋白质含量下降,减弱其对心肌细胞凋亡的抑制作用。因此,衰老大鼠心肌组织中促凋亡和抑凋亡RNS的失衡,有可能通过促进心肌细胞凋亡导致心肌细胞丢失,最终造成心脏收缩和舒张功能的下降。3.与成年大鼠相比,衰老大鼠心肌组织中iNOS表达明显增高;同时,eNOS表达明显下降。产生RNS的酶NOS,在衰老大鼠心肌组织中的表达失调,很可能是导致其RNS失调的原因之一。4.上述结果提示,产生RNS的酶的种类、RNS中的有毒产物和RNS的化学修饰等环节在心肌组织衰老过程中起重要作用。如果在临床工作中采取降低iNOS活性、增加eNOS活性、清除ONOO-或者补充S-亚硝基化蛋白质等干预措施,可能将有助于减轻心肌组织的老化。