目的调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)是具有免疫负调控作用的CD4~+T细胞亚群,国外已开展临床试验将体外扩增的多克隆Tregs回输到1型糖尿病(T1D)患者体内,证实了Tregs治疗的安全性和有效性。然而多克隆Tregs仍存在以下问题:1、所需数量大2、可能引起广泛的免疫抑制。在动物模型中的研究发现:与多克隆Tregs相比,抗原特异性的Tregs所需数量少,并具有更强的抑制作用。本研究旨在构建人靶向ZnT8抗原嵌合抗原受体的调节性T细胞(ZnT8-CAR Tregs),鉴定构建细胞的表型与功能。方法1.构建含有ZnT8抗原单链抗体序列的第三代CAR结构的基因,将该序列克隆到慢病毒载体上。2.通过流式细胞术分选人外周血调节性T细胞,建立在体外用CD3/CD28磁珠联合IL-2刺激高效扩增Tregs的体系。并采用含ZnT8-CAR结构的慢病毒感染人外周血调节性T细胞,构建ZnT8-CAR Tregs,流式细胞术检测病毒感染的阳性表达率,筛选出最佳的感染条件。3.通过流式细胞仪检测ZnT8-CAR Tregs标志分子CD4、CD25、FOXP3、Helios的表达。4.通过混合淋巴细胞反应将ZnT8-CAR Tregs与活化的人PBMC共培养,以体外扩增未感染慢病毒的Tregs作为对照,观察ZnT8-CAR Tregs的非特异性免疫抑制能力。5.通过筛选的ZnT8肽段刺激ZnT8-CAR-Tregs,观察该ZnT8-CAR Tregs的特异性增殖情况。结果1.成功合成含有识别ZnT8抗原单链抗体的CAR结构慢病毒。2.建立体外高效扩增Treg的体系,并成功将含ZnT8-CAR结构的慢病毒感染人外周血来源的Tregs。3.构建的ZnT8-CAR Tregs表达Tregs特异性的分子。4.构建的ZnT8-CAR Tregs在体外能抑制活化的PBMCs增殖。5.构建的ZnT8-CAR Tregs在ZnT8(295-309)肽段刺激下能够特异性增殖。结论本研究采用慢病毒载体构建靶向ZnT8抗原的CAR结构,并成功感染人外周血来源的Tregs,构建了ZnT8-CAR Tregs。本研究所制备的ZnT8-CAR Tregs稳定表达CD4、CD25、FOXP3和Helios等Tregs关键分子且具有免疫抑制能力,同时这群细胞具有ZnT8抗原特异性。