论文部分内容阅读
随着脂肪酶被广泛应用于工业生产中，工业化规模生产具有各种特性的脂肪酶已成为一个亟待解决的问题。短小芽孢杆菌脂肪酶具分子量小，表达、分泌能力强，非水相体系酶学性质突出等优点，是具有较好应用前景的脂肪酶。本实验通过构建短小芽孢杆菌脂肪酶基因及其定向突变后的基因表达载体，并将其转化到适合工业化生产的巴斯德毕赤酵母中进行分泌表达，为短小芽孢杆菌脂肪酶的工业化生产进行了有益探索。
本实验以经过定向突变得到的脂肪酶突变基因BpL-1369和其野生型基因BpL为材料，构建成含有短小芽孢杆菌野生型及其定向突变基因的表达载体pPIC9K-BpL和pPIC9K-BpL-1369，通过电转化将重组质粒转入毕赤酵母GS115中；利用G418 筛选获得高拷贝重组酵母菌株，并经甲醇诱导后，实现了芽孢杆菌脂肪酶在毕赤酵母中的分泌表达。表达产物经SDS-PAGE检测表明，其表观分子量约为25 Kda。工程菌经正交实验初步优化后，获得最佳诱导条件。GS115/pPIC9K-BpL最佳诱导条件为：甲醇添加量1.0％/24h，初始菌浓度4.0（OD600），初始pH 7.0，收获时间96h；GS115/pPIC9K-BpL-1369的最佳诱导条件为：甲醇添加量1.0％/24 h，初始菌浓度4.0（OD600），初始pH 7.0，收获时间108 h。在上述最优条件下，GS115/pPIC9K-BpL脂肪酶的酶活从优化前的1.60 U/mL提高到4.95 U/mL；GS115/pPIC9K-BpL-1369 脂肪酶的酶活从1.85 U/mL提高到5.45 U/mL。