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药源性肝损伤（Drug-induced liver injury,DILI）是药物安全性评价重点关注的药物不良反应,是急性肝衰竭的主要原因。中草药由于人类用药的悠久历史和对疾病具有独特的疗效而被公众广泛接受。但伴随着中草药和膳食补充剂的普及,中草药所引起DILI也开始被世界各地文献报道。中草药引起的肝损伤的几个因素包括中草药在体内的代谢、滥用、质量控制不明确以及提取工艺改变导致毒性部位的富集等。此外,个体及环境差异也是中草药造成DILI的主要原因之一。中草药引起的细胞毒性往往具有隐匿性,对易感个体可能更容易造成肝脏损伤。这些危险因素可能会导致细胞的氧化失衡、免疫应激和胆汁淤积,引起肝脏的内源代谢的阻滞和病理损伤,直接或间接的导致肝毒性。目前为止,大多数中草药的肝毒性物质基础和机制尚未阐明,且对于中草药及其提取物引起的DILI仍然缺乏有效的诊断标志物。因此,识别中草药中的毒性成分对认知和规避用药风险具有重要作用。一、基于斑马鱼肝毒性模型的白鲜皮提取物FRA的代谢毒性机制研究白鲜皮是一种具有抗炎和抗过敏作用的传统草药,但一些研究表明,以白蜡树酮（Fraxinellone,FRA）为代表的几种呋喃环化合物是从CD中提取的主要活性成分,它们自身拥有的呋喃环官能团可通过细胞色素P450（cytochromeP450,CYP450）代谢生成顺丁烯结构而产生肝毒性,但潜在的毒性机制尚未阐明。因此,本实验室利用斑马鱼受精后72小时的斑马鱼幼鱼研究FRA的代谢性肝毒性,并探讨其毒性作用的分子机制。我们采用流式细胞术、实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR）和 western blot 研究 FRA 的体内 肝毒性机制,并通过靶向氨基酸代谢组学进一步进行系统验证。结果表明,FRA（10-30μM）可引起斑马鱼的肝损伤和氨基酸代谢组学的明显改变。FRA可上调JNK/p53/Bax通路,促进线粒体膜电位失衡,导致活性氧（Reactive oxygen species,ROS）增加,并通过下调 P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、胆酸盐外排泵（bile salt export pump,Bsep）和牛磺胆酸钠共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide,Ntcp）的表达,介导胆汁淤积性肝损伤。此外,添加CYP3A抑制剂酮康唑（Ketoconazole,KCZ）（1 μM）可显著降低FRA的肝毒性。靶向代谢组学分析表明,氨基酸水平的变化可以与分子生物学相结合,阐明FRA诱导肝毒性的机制,氨基酸代谢监测可能为FRA的药物性肝损伤防治提供新的途径。同时,我们发现斑马鱼具有相对丰富的代谢酶和转运体表达,适合于胆汁淤积型肝毒性药物的筛选和机制探索,为评价和发现药物潜在的肝毒性提供一定的方法学参考。二、何首乌提取物HY-W-26的体外肝毒性及机制研究HY-W-26是从蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb中提取分离得到的一种二蒽酮类化合物。前期本实验室通过斑马鱼肝毒性筛选模型确认了 HY-W-26 具有较高的肝毒性潜力。现在 已经报道的何首乌肝毒性物质主要是围绕蒽醌、酚类等化合物,对二蒽酮类化合物诱导的细胞损伤还未有明确的机制报道。为更好得了解二蒽酮介导的DILI,我们使用HepG2细胞评估HY-W-26的肝毒性。结果表明,HY-W-26具有较强的肝毒性,能显著降低HepG2细胞的存活率,诱导细胞凋亡。生化指标检测检测显示,HY-W-26增加细胞培养上清液中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的水平和细胞中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）的水平。与对照组相比,不同浓度的HY-W-26可以导致HepG2细胞中谷胱甘肽（glutathione,GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）水平的降低,脂质氧化产物丙二醛（malondialdehyde,MDA）和ROS含量的升高。HY-W-26还可以降低线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）,促进细胞色素C（Cytochrome c,Cyt c）的释放,剂量依赖性的增加JNK、Bax、cleaved Caspase-3和-9的表达水平以及和PARP的裂解,并降低Bcl-2和DFF45的水平。此外,我们还发现HY-W-26可以抑制PI3K和mTOR的磷酸化,增加活化AKT的水平。我们认为AKT的活化可以增加细胞对ROS的敏感性而加速细胞凋亡。HY-W-26还可以抑制参与抗氧化相关基因的表达水平,这与ROS的升高和氧化还原失衡有着直接关系。本研究证明,HY-W-26的肝毒性机制与线粒体损伤和ROS的增加有关。HY-W-26可以通过抑制抗氧化系统诱导细胞的氧化应激和凋亡效应。此外,JNK和AKT的激活会启动ROS驱动的凋亡级联反应,增加ROS介导的细胞损伤。这项研究强调了 ROS应激参与何首乌诱导肝毒性的重要性。同时,现在有关何首乌肝毒性报道主要是围绕以大黄素为主的单蒽醌类化合物,我们希望通过对二蒽酮化合物的毒性研究来丰富何首乌的潜在肝毒性物质基础。