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研究目的1.研究缺氧诱导因子2α(hypoxia inducible factor 2α,HIF-2α)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)简称肝癌患者肿瘤组织及血清中的表达,探讨HIF-2α的表达与患者临床病理因素、预后及血管生成之间的关系,探讨血清中HIF-2α蛋白对于肝癌的诊断价值。2.研究普通培养及氯化钴模拟缺氧培养条件下人肝癌细胞株MHCC-97H、Hep3B、Hep G2、HCCLM3、Huh-7和人肝细胞HL-7702中HIF-2αm RNA及蛋白表达水平,并筛选合适细胞株进行后续研究。3.研究RNA干扰HIF-2α基因表达后肝癌细胞功能学改变。4.探讨HIF-2α基因在肝癌中的作用机制。研究方法1.收集具有完整病例及随访资料的90例患者肝癌组织标本,免疫组织化学法检测肝癌组织中HIF-2α和血管生成相关指标VEGF、CD34的表达,探讨HIF-2α的表达与患者临床病理因素、血管生成及生存预后的关系。酶联免疫吸附试验ELISA检测患者术前血清中HIF-2α的表达,受试者工作曲线(Receiver operating characteristics,ROC)分析比较HIF-2α和血清AFP值单独以及联合对肝癌的诊断价值。2.对人肝癌细胞株MHCC97H、Hep G2、HCCLM3、Hep3B、Huh-7以及人肝细胞HL-7702进行普通培养和氯化钴模拟缺氧培养,运用实时荧光定量PCR技术和Western blot法检测各细胞株普通培养及缺氧模拟情况下HIF-2αm RNA及蛋白表达情况,并选取合适细胞株进行后续实验。3.HIF-2α特异性si RNA慢病毒感染人肝癌细胞株,使用RT-PCR检测RNA干扰的有效性,确定si RNA干扰HIF-2α表达有效后进行细胞增殖、凋亡及侵袭实验,初步探讨HIF-2α在肝癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移等方面的作用。4.采用affymetrix基因芯片检测人肝癌细胞HIF-2α基因表达下调后,全基因表达谱的变化,并应用T检验,找到成对样本间的差异基因列表,利用KEGG数据库对差异基因进行pathway注释,和GO分析即对差异基因进行biological process、molecular function以及cellular component注释,对相关基因和信号通路进行综合分析。研究结果1.90例肝癌组织中HIF-2α阳性者69例(76.7%),显著高于癌旁组织(11/90,12.2%),且HIF-2α高表达的患者血管浸润发生率高、肿瘤包膜多不完整、肿瘤TNM分期晚以及病理Edmondson分级高。HIF-2α的表达与肿瘤血管生成重要的促进因子VEGF的表达呈现显著相关性(p<0.001),且与肝癌组织中微血管密度(microvessel density,MVD)呈正相关(p<0.001),提示HIF-2α可能促进肝癌血管生成。HIF-2α阳性表达的患者预后无复发生存期DFS(p<0.001)和总生存期OS(p<0.001)均较阴性者差,多因素分析,HIF-2α高表达的患者的OS(p=0.030)和DFS(p=0.005)均显著低于HIF-2α阴性表达者。肝癌患者术前血清中HIF-2α水平明显增高,且其表达与血管浸润、肿瘤包膜、肿瘤TNM分期、病理Edmondson分级以及肝硬化程度相关,ROC曲线分析提示HIF-2α联合AFP可提高肝癌检出率。2.各肝癌细胞株和人肝细胞株缺氧培养较普通培养HIF-2αm RNA表达水平无明显差异,而普通培养时蛋白水平普遍较低,缺氧培养时则呈不同程度升高,人肝癌细胞株Hep3B升高最显著,故用于后续实验。3.si RNA慢病毒感染Hep3B细胞后,RT-PCR检测结果显示HIF-2α基因表达显著下调,MTT测定si RNA干扰组肝癌细胞生长抑制率显著高于对照组;Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测结果显示si RNA干扰组细胞凋亡数明显增加。4.RNA干扰人肝癌细胞株Hep3B中HIF-2α表达后,基因表达谱芯片检测差异表达的基因。结果发现1352个基因表达发生明显改变,其中上调674个,下调基因数为678个。差异基因主要涉及30个信号通路,包括MAPK信号通路、Wnt信号通路、细胞凋亡、Notch信号通路等重要信号调节通路。结论1.人肝癌组织中HIF-2α高表达,其表达与血管浸润、肿瘤包膜、TNM分期以及病理分级相关;HIF-2α的表达与肿瘤血管生成密切相关,可作为肝癌患者术后预后预测的独立危险因素;联合血清HIF-2α和AFP检测可提高肝癌检出率;HIF-2α可能作为肝癌早期诊断及预后预测的潜在分子标记物。2.缺氧培养条件下人肝癌细胞株和人肝细胞株HIF-2α的m RNA表达水平较普通培养无明显改变,蛋白水平则不同程度提高,进一步证实了HIF-2α的表达是受氧依赖的转录后水平的调控,并筛选出人肝癌细胞株Hep3B用于后续实验。3.RNA干扰技术成功下调了人肝癌细胞株Hep3B中HIF-2α基因的表达,成功构建了转染HIF-2α特异的si RNA和转染阴性对照病毒的肝癌细胞株。人肝癌细胞株Hep3B基因下调后,肿瘤细胞增殖受抑制、凋亡数增加,表明HIF-2α基因在促进肝癌细胞增殖及抑制凋亡中起重要作用。4.RNA干扰HIF-2α表达后,基因表达谱芯片筛选出差异表达基因1352个,进一步研究差异表达的基因,有助于揭示HIF-2α在肝癌中作用的分子机制。