奶牛乳房炎是一种能引起乳房炎症的疾病,也是奶牛最为常见的疾病之一,它给养殖业带来巨大的经济损失,同时也给公共卫生安全带来了巨大的隐患。本研究内容和主要结果如下。1、对从奶牛乳房炎病例中分离的33株金黄色葡萄球菌进行溶血素基因型和表型检测,并对它们之间的相关性进行分析。结果表明:hla、hlb、hld、hlg、hlg-2基因的检出率分别为90.91%、100%、93.94%、78.79%、66.67%;金黄色葡萄球菌在牛血和绵羊血琼脂平板上均以β溶血为主,但牛血检测出的β溶血比例更高,溶血素基因型和表现型之间无对应关系。2、将β-溶血素基因定向插入到pcDNA3.1 HisB载体上,成功构建了重组的真核表达载体pcDNA3.1 HisB-hlb。用脂质体法将其转染入人乳腺癌细胞内,使用G418筛选出稳定转染的细胞系,用PCR、Western blot等方法检测检测重组质粒的转染情况。发现pcDNA3.1 HisB-hlb已成功转染入细胞内并正确表达β-溶血素。3、用镍柱亲和层析法对表达产物进行纯化,并测定纯化后的β-溶血素对牛和绵羊红细胞的溶血效价,SDS-PAGE电泳显示纯化产物纯度达电泳纯,并在41.8KDa呈现单一条带,对牛红细胞和绵羊红细胞的溶血比活分别为1658HU/mg和829HU/mg。4、分别将纯化的β-溶血素和pcDNA3.1 His B-hlb与福氏佐剂乳化混合,制成亚单位疫苗和DNA疫苗,通过不同的途径对小鼠进行免疫,强化免疫10天后,用ELISA法检测白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、免疫球蛋白G、分泌性免疫球蛋白A和γ-干扰素等的浓度,同时用金黄色葡萄球菌对小鼠攻毒,对免疫效果进行初步评价。结果表明,各实验组的免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)的浓度远大于对照组,差异显著;β-溶血素和和pcDNA3.1HisB-hlb对小鼠均有一定的保护能力。