论文部分内容阅读
星虫虽为低等无脊椎生物，但具有很强的抗逆性。为了充分利用海洋资源，挖掘功能成分，本文首先利用光学显微镜、电子显微镜及高压液相色谱等仪器，解析了可口革囊星虫体壁、体液的组成和营养成分；利用胃蛋白酶和醋酸、柠檬酸、盐酸提取星虫体壁胶原蛋白，并利用电泳、红外光谱仪、差示扫描量热测定仪、高压液相色谱、扫描电镜、原子力显微镜等仪器研究了胶原蛋白的理化性质，利用小白鼠创伤愈合实验证明该胶原蛋白的生物学功能。利用双水相萃取、等电点沉淀及离子交换层析等方法从星虫体液中提取、纯化蚯蚓血红蛋白。利用分子生物技术构建了星虫的cDNA文库，克隆出了蚯蚓血红蛋白基因、胶原蛋白基因、铁结合蛋白基因和热休克蛋白基因。结果如下：
首先，利用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜，研究了星虫体壁的显微与亚显微结构，确定了星虫的体壁主要由表皮层和肌肉层构成。其中表皮层包括角质层、上皮细胞、表皮附属物、胶原纤维层和基底膜；肌肉层包括环肌层、纵肌层和体腔膜。体表分布有许多不连续的突起，顶端开口在体表；基底膜由一层扁平上皮细胞构成；星虫体壁肌肉为平滑肌，且尾部纵切可见环肌间有许多分泌细胞。体腔内充满粉红色的体液。体液由红细胞、颗粒细胞、生殖细胞和桑椹胚细胞等组成。红细胞折叠成各种形状，多数红细胞的细胞质内看不到如线粒体或核糖体等细胞器，这些可能与红细胞的新陈代谢方面所需能量低有关。而且，在卵细胞含量多的星虫体液中，红细胞折叠的更厉害，并使体液呈深褐色。颗粒细胞分大小两种，小颗粒细胞具有变形功能，能吞噬外来异物。体液内一年四季均可发现生殖细胞，但桑椹胚细胞只在4月份的样品中发现。体液中富含氨基酸和脂肪酸，它们不仅仅是营养物质，也是调节星虫渗透压的重要成分之一。星虫用酸性、碱性及中性氨基酸来维持体液内环境，以适应外界环境因子的变化。星虫体液中共含有18种脂肪酸，总含量为0.69 mg/ml；其中，饱和脂肪酸含量为0.22 mg/ml，占脂肪酸总量的32.88％，以软脂酸为最高；不饱和脂肪酸含量为0.47 mg/ml，约占脂肪酸总量的68.12％，其中单不饱和脂肪酸总含量为0.22 mg/ml，占脂肪酸总量的32.88％；多不饱和脂肪酸总含量为0.25mg/ml，约占脂肪酸总量的36.52％。结果证明星虫是一种高蛋白、低脂肪、无机元素丰富、食用较安全的海洋生物。
其次，通过正交实验确定了利用酶法提取胶原蛋白的条件是：4℃，底物浓度1％，0.5 mol/L醋酸(pH=1.7-2.0)，酶浓度2％，水解时间72h；提取液中直接加入NaCl溶液盐析沉淀胶原蛋白，透析除盐，真空冷冻干燥得到成品。醋酸、柠檬酸、盐酸可提取星虫体壁胶原蛋白，但比较之后以0.5 mol/L醋酸提取的胶原蛋白效果最佳。星虫体壁胶原蛋白为I型，由a、B、γ三亚基构成。红外光谱检测中，在1651cm-1附近出现了较强的羰基(C＝O)吸收峰，在1235 cm-1-1450 cm-1范围内存在( N-H)吸收峰。在星虫体壁胶原蛋白的氨基酸组成中，1/3是甘氨酸，蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等含量很少，脯氨酸和羟脯氨酸的总量所占比例为208/1000；星虫的胶原蛋白可以形成中空膜状结构，纳米颗粒较均匀，是最好的药物载体。该胶原蛋白溶液的粘度随浓度的增大而增大，随着温度的升高而下降；酸性条件下，粘度总体呈下降趋势，碱性时粘度变化不大，而外加中低浓度的电解质与非电解质对胶原蛋白溶液粘度的影响并不显著。星虫胶原蛋白对小鼠皮肤无致敏反应，对创面愈合有明显的促进作用，说明所提取的胶原蛋白不仅可以应用于食品与化妆品行业，还可以进一步应用于生物医学材料等高附加值领域。
最后，构建了可口革囊星虫的cDNA文库，文库的插入片段集中分布于750-2000bp，平均大小均在1000bp。扩增丈库的滴度约为1.7×105 cfu/ml。星虫是位数不多含血红蛋白的低等无脊椎动物，克隆出的蚯蚓血红蛋白基因与邱米管体星虫(Siphonosoma cumanense Keferstein)、普通戈芬星虫(Golfingia vulgaris deBlainville)、光裸方格星虫(Sipunculus nudus L.)、古氏仿革囊星虫(Phascolopsisgouldii Pourtales)、异常枝触星虫(Themiste dyscritum)等五种星虫的氨基酸序列同源性分别为67％，50％，62％，45％，47％，氨基酸序列相似性分别为73％，65％，73％，59％，62％。也克隆出了832bp的胶原蛋白基因。从可口革囊星虫文库调出的ferritin基因与皱纹盘鲍等软体动物、刺参等棘皮动物的ferritin基因的核苷酸序列同源性在70％以上，最高达到了75％，并且与鱼类的叉尾鮰、两栖类的非洲爪蟾、哺乳类的小家鼠、甚至于人的ferritin基因也具有相当高的同源性。同样地，氨基酸序列同源性也都在70％以上，相似性更是高达80％以上，最高达到了89％。可口革囊星虫体液中含有可溶、无毒和生物体可利用的形式的铁，是未经人工改造的补血保健食品。热休克蛋白(HSP)70基因与企鹅珠母贝、近江牡蛎、栉孔扇贝、斑节对虾、人的基因序列同源性分别为86％，89％，89％，88％，87％，氨基酸序列相似性分别为93％，94％，95％，95％，93％。与其他物种的HSP70基因也表现出高度的同源性。