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柑橘溃疡病是由柑橘溃疡病菌引起的一种世界性检疫病害,危害严重,防治困难,对柑橘产业造成了巨大损失。加强对柑橘溃疡病菌的检测,只能暂缓病情形势的发展,找到抗病柑橘资源、培育抗病品种是最根本的解决途径。本研究拟利用激光共聚焦扫描显微镜技术实时观察e GFP标记的柑橘溃疡病菌对抗病种质枸橼C-05和感病种质冰糖橙的叶片的侵染和定值过程,比较分析病原菌对不同种质的入侵途径、入侵量和入侵后植物组织内变化的差异,并分析侵染后不同寄主的症状差异,为柑橘溃疡病菌与柑橘不同种质的互作研究提供了直观的技术方法。FLS2是柑橘防御相关基因,在植物防御反应,位于质膜的FLS2特异性识别细菌鞭毛蛋白,从而引起一系列的防御反应。项目组前期研究结果表明,柑橘叶片感染柑橘溃疡病菌后,鞭毛蛋白受体基因FLS2的表达在抗病材料中显著上升,而在感病材料中呈下降趋势;本研究进一步分析比较了二者在溃疡病菌入侵后FLS2基因结构及其启动子结构的差异,并分析了在抗病和感病种质冰糖橙和枸橼C-05中FLS2基因对溃疡病菌入侵的可能作用。本研究主要研究结论如下:(1)溃疡病接种实验需采用完全展开且叶面积达到最大叶面积1/2的柑橘幼叶。因柑橘为常绿植物,有多种叶龄和大小的叶片,因此本研究采集柑橘不同叶龄大小的叶片喷雾接种溃疡病菌,置于恒温保湿的条件下持续观察叶片表现的症状,发现25天后最大叶面积1/2的柑橘幼叶所表现出的病症最为严重,新叶和成年叶只有轻微的发病症状,而老叶未观察到病斑的产生,重复多次后仍观察到相似的结果,因此叶片展开面积达到1/2最大叶面积的柑橘幼叶最适于Xcc接种观察。(2)用激光共聚焦扫描显微镜观察e GFP标记的柑橘溃疡病菌入侵柑橘叶片组织的动态过程,结果如下:在接种48 h后,Xcc已入侵到叶片组织内部,病菌在感病材料冰糖橙的大量繁殖加速了病情的发展,使其于接种60 h后发病,而抗病材料枸橼C-05则在接种72 h后才表现症状;对比发病症状后发现,冰糖橙会出现火山口状的病斑以及叶片组织溃烂等症状,而枸橼C-05虽然也会生成病斑,但其病斑以及病斑周遭叶片组织的发病症状却表现为褐化、萎缩和干枯;对接种后的柑橘叶片进行切片观察,对比Xcc对叶片表面的入侵情况发现,病菌在整个接种区域(包括气孔和气孔以外的叶片表皮组织)都有入侵,表明病菌对于气孔入侵并没有主动选择性,可以从叶片表皮组织随机入侵;用Z-stack技术对注射接种后的柑橘叶片进行断层扫描发现:柑橘叶肉细胞中没有观察到病菌的明显迹象,溃疡病菌主要集中在叶肉细胞间隙,据此推断柑橘溃疡病菌的定殖主要在细胞间隙进行;冰糖橙叶片组织发病后,叶表形成的火山口凸起明显多于枸橼C-05,冰糖橙叶片组织中的病菌量明显大于枸橼C-05中的病菌量。以上结果表明,枸橼C-05叶片中可能出现了某种反应机制,使叶片组织坏死从而对柑橘溃疡病菌的繁殖产生抑制作用。(3)用TA克隆在冰糖橙和枸橼C-05中扩增了FLS2-1和FLS2-2基因,并对这两个基因进行了生物信息学分析。冰糖橙FLS2-1和FLS2-2基因的c DNA片段长度分别为3132 bp和3129bp;枸橼C-05 FLS2-1和FLS2-2基因的c DNA片段长度分别为3129 bp和3126bp,分别编码1043、1042个氨基酸和1042、1041个氨基酸。冰糖橙和枸橼C-05中FLS2-1和FLS2-2的氨基酸序列同源性为分别为97.03%和99.62%,说明同一柑橘材料间的两个等位基因的氨基酸序列差异很小。而冰糖橙与枸橼C-05之间FLS2-1氨基酸序列的同源性为92.91%;冰糖橙与枸橼C-05之间FLS2-2氨基酸序列的同源性为94.53%。通过对不同抗感病材料中FLS2基因的蛋白功能结构域和二三级结构分析发现,该基因结构的分析结果与报道的拟南芥和水稻中的FLS2基因的蛋白结构一致,均含有胞外结构域,跨膜结构与和胞内激酶域,其中枸橼C-05含有17个胞外LRR结构域,该元件在冰糖橙中缺失,可能与其感病性相关;除此之外两材料中该蛋白的其他功能结构域和二三级结构没有明显差异,这表明冰糖橙和枸橼C-05中该基因结构与FLS2基因的表达没有必然联系。(4)克隆了冰糖橙、枸橼C-05的FLS2-1基因的启动子,其中冰糖橙的启动子有1579 bp和1662 bp序列大小不同两类,且数量比约为1:1;两类启动子与枸橼C-05的FLS2-1基因启动子序列的同源性为95.89%。对比其启动子序列的顺式作用元件,发现冰糖橙和枸橼C-05中均含有与抗性相关的启动子作用元件-Box-W1元件,且两材料中该作用元件的序列与报道中Box-W1元件的序列一致,但枸橼C-05比冰糖橙1579 bp大小的FLS2-1基因启动子多一个该元件;冰糖橙中存在有高转录水平的顺式作用元件(5UTR Py-rich stretch)和激发响应元件(ELI-box3),这两个作用元件在枸橼C-05中不存在。在冰糖橙1579 bp大小的FLS2-1基因启动子序列中,激发响应元件(ELI-box3)是其特有的一个作用元件。将冰糖橙1579 bp大小的启动子缺失序列于NCBI比对后发现,792 bp~817 bp处缺失的序列可能是柑橘DEXH盒;冰糖橙中,茉莉酸甲酯诱导元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)缺失,这两个元件的缺失可能与冰糖橙的高感病性有关。