第一部分IL-35在原发免疫性血小板减少症免疫失耐受中的作用研究　　背景:原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一种自身免疫介导的出血性疾病，由于免疫失耐受体内产生针对自身血小板的抗体，导致血小板破坏过多及生成减少。IL-35为IL-12家族的新成员，是在机体炎症反应过程中由活化的天然型调节性T细胞(nTreg)产生的一种细胞因子。它能诱导效应T细胞分化为可分泌IL-35的诱导型调节性T细胞(iTr35)，从而形成级联放大效应，最终产生感染耐受。既往研究发现维持机体免疫平衡的nTreg在ITP患者外周血中存在数量减少及抑制功能的减弱，且ITP患者外周血血浆中IL-35的水平显著下调，且与血小板计数呈正相关，提示IL-35可能参与了ITP的发病，但具体的机制尚不清楚。　　目的:我们拟通过本研究阐明IL-35在ITP患者中下调的原因及在免疫失耐受中的作用，同时评价体外诱导iTr35对血小板特异性自身免疫的调节作用，为基于IL-35的靶向治疗提供依据。　　方法:(1)收集患者临床资料;(2)流式细胞术检测ITP患者外周血中调节性T细胞和辅助性T细胞（Th1和Th17）及IL-35刺激对后CD4+、CD8+和调节性T淋巴细胞的表达水平的影响;(3) Brdu细胞掺入法检测IL-35对外周血单个核细胞(PBMCs)增殖的影响;(4) ELISA方法检测ITP患者血浆中IL-35的水平以及IL-35刺激前后PBMCs培养上清中IFN-γ、IL-10、 IL-17和TGF-β1的水平变化。　　结果:(1)活动期ITP患者血浆中IL-35的浓度明显低于缓解期患者及正常对照组，缓解期ITP患者血浆中IL-35的浓度明显低于正常对照组。(2)与正常对照组相比，ITP患者外周血中nTreg的细胞比例明显下降，Th1细胞比例明显上调，而Th17细胞比例无统计学差异。(3) ITP患者血浆中下降的IL-35表达水平与患者血小板计数、外周血nTreg的细胞比例呈正相关，与Th1细胞比例呈负相关，与Th17细胞比例无关。(4)外源性IL-35的加入能明显抑制活动期ITP患者PBMCs的增殖，进而行流式细胞术检测显示IL-35能抑制CD4+及CD8+T细胞的增殖，但能促进nTreg的分化。(5)IL-35促进ITP患者PBMCs产生更多的TGF-β1和IL-10，但却抑制其产生IFN-γ和IL-17。　　结论:原发免疫性血小板减少症患者外周血中降低的IL-35可能通过调节自身T细胞及相关细胞因子参与其免疫失耐受。　　第二部分干扰素α-2b对原发性血小板增多症患者异常骨髓间充质干细胞生物学特性及功能的系统研究　　背景:原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)是一种费氏染色体阴性的慢性骨髓增殖性肿瘤，临床上以出血倾向和血栓形成为特点。约55％的患者存在JAK2基因突变。以往的研究主要集中于存在突变的造血干/祖细胞损伤机制方面，但因造血干/祖细胞功能缺陷、体外不易扩增和易分化等缺点限制了此方面研究。最近有研究指出ET患者骨髓造血微环境可能存在缺陷。因此，研究骨髓造血微环境中的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)——各种细胞成分的前体细胞的生物学特性及其功能对于ET患者发病机制的研究具有重要意义。近三十年来，干扰素α-2b（IFNα-2b）因其抗肿瘤效应、延缓骨髓纤维化进展以及无白血病转化风险等特点在临床上被广泛应用于ET患者的治疗，但对于其作用机制目前主要集中在IFNα-2b对恶性造血干/祖细胞效应方面的研究，其对骨髓微环境的影响目前尚不清楚。因此，深入了解IFNα-2b对ET患者骨髓微环境的影响显得尤为重要。　　目的:本研究旨在系统、全面地比较研究ET患者和正常人BM-MSCs生物学特性及功能的差异，为探讨ET患者BM-MSCs损伤机制提供实验基础及理论依据，同时为ET患者发病机制研究探讨新思路。在证实ET患者骨髓间充质干细胞存在缺陷的基础上进一步探讨IFNα-2b对ET患者异常BM-MSCs的生物学特性及功能的影响，为IFNα-2b应用于ET患者的临床治疗提供新的理论和实验依据。　　方法:(1)从ET患者和正常人骨髓组织中采用贴壁、传代培养的方法获取相对纯化的骨髓间充质干细胞;(2)倒置显微镜观察BM-MSCs形态变化;(3)流式细胞仪检测BM-MSCs表面标志;(4)在诱导体系中，定向诱导BM-MSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化，用油红O染色、茜素红染色观测脂滴形成、钙盐沉积情况，比较成脂、成骨的分化潜能;(5)应用CCK-8试剂盒测定BM-MSCs增殖情况并绘制增殖曲线;(6)流式细胞仪方法检测BM-MSCs的细胞凋亡情况;(7)磁珠分选脐血来源的CD34+细胞，在两种培养体系（LTC assay和MK assay）中共培养BM-MSCs与CD34+细胞，比较研究ET患者和正常BM-MSCs扩增CD34+细胞能力和促进造血克隆（CFU-G、CFU-M、CFU-GM、CFU-Mix、BFU-E和CFU-MK）形成的能力;同时比较两种BM-MSCs表达造血生长因子（SCF、IL-6和VEGF）的异同。(8)建立BM-MSCs和正常来源的外周血单个核细胞(PBMCs)共培养体系，比较两种BM-MSCs对活化后的PBMCs增殖及促进PBMCs向Treg细胞分化能力的差异。(9)若与正常来源的BM-MSCs相比，ET患者来源的BM-MSCs在上述生物学和功能检测中存在异常，则利用上述方法检测IFNα-2b对ET患者来源的异常BM-MSCs的生物学特性及功能的影响。　　结果:(1)成功培养并获取高纯度的ET患者和正常人来源的BM-MSCs;(2)在倒置显微镜下观察发现，ET患者BM-MSCs与正常BM-MSCs形态无明显差异，二者BM-MSCs细胞均纤细、呈长梭形，规则排列生长。(3)二者BM-MSCs均高表达CD90、CD73、CD105，且表达情况无显著差别。二者均不表达造血细胞标志CD11a、CD14、CD19、CD34、CD45及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。(4)在诱导培养体系下，二者BM-MSCs均有向成骨细胞、脂肪细胞分化的能力。与正常BM-MSCs相比，ET患者BM-MSCs分化为脂肪细胞的能力无明显变化，但分化为成骨细胞的能力减弱。(5) ET患者BM-MSCs增殖能力明显强于正常BM-MSCs。(6) ET患者BM-MSCs较正常人BM-MSCs的细胞凋亡明显减少。(7)与脐血来源的CD34+细胞共培养后，ET患者BM-MSCs扩增CD34+细胞能力和促进造血克隆形成能力（尤其是支持长期造血能力和巨核细胞系造血能力）较正常BM-MSCs显著减弱。两种BM-MSCs均表达SCF、IL-6和VEGF，但ET患者来源的BM-MSCs上述细胞因子表达水平低于正常来源的BM-MSCs。(8)与正常来源的PBMCs共培养结果显示，ET患者BM-MSCs抑制PBMCs增殖能力减弱但促进PBMCs向调节性T细胞分化的能力有增强趋势，但尚无统计学差异。(9) ET患者来源的BM-MSCs形态和表面标志不受IFNα-2b的影响，但IFNα-2b可使ET患者的BM-MSCs向成骨细胞、脂肪细胞定向诱导时钙盐沉积和脂滴形成明显减少，抑制其成骨、成脂分化潜能。IFNα-2b可抑制ET患者来源的BM-MSCs的增殖，增加其凋亡和增强其支持造血的能力。IFNα-2b可促进ET患者的BM-MSCs表达SCF、IL-6和VEGF。另外，IFNα-2b还可增强ET患者的BM-MSCs对PBMCs的抑制作用及促进PBMCs向调节性T细胞分化的能力。　　结论:(1)原发性血小板增多症患者骨髓间充质干细胞存在多方面、多层次的缺陷。(2)原发性血小板增多症患者BM-MSCs存在多种生物学特性异常，包括增殖能力增强、多向分化能力异常（不易向成骨细胞方向分化）、细胞凋亡减少。(3)原发性血小板增多症患者BM-MSCs支持造血能力（尤其支持长期造血能力和巨核细胞系造血能力）减弱。(4)原发性血小板增多症患者BM-MSCs抑制正常来源的外周血单个核细胞增殖能力减弱，但可促进外周血单个核细胞向调节性T细胞分化。(5) IFNα-2b可影响原发性血小板增多症患者BM-MSCs多种生物学特性及功能，包括增殖、凋亡、分化、支持造血及免疫调节等多个方面。