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目的：建立适用于当归的ISSR-PCR最佳反应体系，对不同产区栽培当归居群进行遗传多样性和遗传结构研究。方法：采用正交试验设计和单因素试验设计对反应体系中各种影响因素进行优化，应用优化后体系对41个不同居群栽培当归样本进行ISSR-PCR扩增，利用Popgen1.32软件分析Shannon’s多样性信息指数(I)等遗传信息参数，应用NTSYS软件构建其遗传距离的UPGMA聚类图，并对统计数据进行遗传多样性和遗传结构分析。结果：最佳反应体系(20μL)为：10×PCR Buffer (Mg2+Plus)2.0mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U，dNTPs0.25mmol/L，Primer0.4μmol/L以及Template DNA30ng；筛选出6条扩增条带较多、背景清晰的引物对41个居群的804个栽培当归样品进行PCR扩增，共检测到54个位点，其中多态性位点46个，多态性比率为85.19%，Shannon’s信息指数(I)平均值为0.4436，Nei’s基因多样度(H)平均值为0.2999；通过Popgen软件分析得到栽培当归居群的Ht为0.3012，Hs为0.0204，根据Ht和Hs来计算Gst为0.9322，居群间基因流估计值Nm为0.0364；不同产区的栽培当归之间遗传距离的变异范围是0.3994-1.0000。结论：建立的当归ISSR-PCR反应体系可用于当归分子遗传学研究；各指数均显示出甘肃栽培当归遗传多样性在物种水平上较高，但与多数其他栽培药材相比偏低或持平，且居群内的遗传多样性水平明显低于居群间；甘肃栽培当归不同居群间的遗传分化较明显，且各居群间基本无基因交流。