论文部分内容阅读
第一部分DHA对肝癌HepG2、前列腺癌PC-3、胃癌SGC7901及结肠癌Caco2细胞增殖抑制的研究目的:比较双氢青蒿素(DHA)对四种肿瘤细胞的体外生长抑制作用,以筛选出最敏感的细胞株进行作用机制的研究。方法:噻唑蓝(MTT)比色法评价DHA对人肝癌HepG2,前列腺癌PC-3,胃癌SGC7901及结肠癌Caco2细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测DHA对上述四种细胞凋亡率的影响。结果:四种细胞的各对照组与DMSO组之间细胞增殖比较无统计学差异(P>0.05);DHA对每种细胞的抑制率与DHA浓度和作用时间正相关(P<0.05),相同时间,HepG2各浓度组的抑制率与其他三种细胞相应浓度组比较有明显差异(P<0.01,除外25μmol/L DHA 24h组P<0.05);作用24h后,每种细胞株各DHA浓度组的细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.01)。四种细胞株中,DHA对HepG2细胞的抑制作用最强,其中DHA(200μmol/L)作用48h时达最高增殖抑制率(86.46±19.65)% , DHA(100μmol/L)作用24时达最高凋亡率(31.74±2.80)%。结论:DHA明显抑制四种细胞株的增殖并诱导其凋亡,其中HepG2最为敏感。第二部分DHA诱导人肝癌HepG2细胞凋亡启动因素的研究目的:探讨DHA诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的启动因素。方法:用0、50、100和200μmol/L DHA作用HepG2细胞6h、24h后,采用荧光探针2’,7’-二氯二氢荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)及Fluo-3AM装载检测细胞内活性氧(ROS)含量及Ca2+浓度;采用流式细胞仪检测线粒体膜电位(ΔΨm)变化及透射电镜观察DHA作用HepG2后细胞超微结构的变化。结果:与对照组相比,DHA作用细胞后,细胞内荧光度值显著增加(P<0.01),且具有明显的浓度与时间依赖性,而具有浓度依赖的胞浆游离Ca2+浓度增加及线粒体膜电位降低均出现在DHA作用24h组;DHA100μmol/L作用24h透射电镜观察,可见大量凋亡细胞及内质网显著扩张。抗氧化剂NAC(5mmol/L)可明显抑制DHA的上述作用。结论:DHA明显增加细胞中ROS水平及Ca2+浓度,降低线粒体膜电位,ROS的产生可能位于上游环节。第三部分DHA诱导人肝癌HepG2细胞内质网应激凋亡信号转导机制的研究目的:研究DHA诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的内在作用机制。方法:用DHA、DHA+NAC及DHA+SP600125作用HepG2细胞, MTT比色法检测细胞增殖抑制的效果;流式细胞术检测细胞凋亡的情况;扫描电镜观察DHA作用后细胞超微结构的变化;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CHOP, XBP1及ATF4 mRNA的表达,蛋白印迹技术(Western Blot)及免疫细胞化学检测CHOP, p-JNK, Bax及Bcl-2蛋白的表达。结果:DHA对HepG2细胞的增殖抑制率与DHA浓度和作用时间相关(P<0.05),NAC在24h及48h均可抑制DHA的作用,除JNK的特异性抑制剂SP600125在48h高浓度组(50,100,200μmol/L)对DHA的作用没有明显影响外,在其他组中可部分抑制DHA的作用;DHA组24h细胞凋亡率明显高于对照组,且与DHA浓度正相关(P<0.05),NAC及SP600125均可抑制DHA的作用;电镜观察显示,DHA作用后细胞表面微绒毛减少和消失,凋亡细胞可见大小不等球状的突起及凋亡小体,坏死细胞的细胞膜破裂,胞浆外溢;RT-PCR检测发现DHA可上调CHOP, XBP1u、XBP1s及ATF4 mRNA的表达,Western Blot及免疫细胞化学检测发现DHA上调CHOP及Bax蛋白的表达,下调Bcl-2表达,NAC可抑制DHA对上述相关基因与蛋白的调节;Western-Blot在DHA作用6h时检测出JNK的磷酸化,NAC及SP600125均可抑制p-JNK的表达。结论:DHA激活UPR的三条信号通路(PERK、ATF6、IRE1),通过激活CHOP, JNK而诱导内质网应激凋亡途径,ROS在这一过程中具有重要的作用。第四部分DHA对裸鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤生长抑制的研究目的:研究DHA对裸鼠人肝癌HepG2移植瘤生长的抑制作用。方法:采用皮下接种肝癌HepG2细胞悬液的方法构建裸鼠的移植瘤模型,观察DHA在体内对HepG2细胞的生长抑制作用;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化检测CHOP、Bax、Bcl-2及p-JNK的表达情况;透射电镜观察肝癌组织超微结构的改变。结果:与对照组相比,瘤体积及瘤重量明显降低(P<0.05),抑瘤率达50.91%,而对照组与DHA组裸鼠体重无明显差异(P>0.05);RT-PCR及免疫组化显示DHA可上调肿瘤组织中CHOP、Bax的表达水平,下调Bcl-2的表达,差异有统计学意义(P<0.05),p-JNK在两组中均无表达;透射电镜观察,DHA治疗后,移植瘤组织可见细胞凋亡形态学改变,内质网腔明显扩张、线粒体肿胀。结论:DHA可抑制裸鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤的生长,内质网应激凋亡途径可能参与了DHA的这一作用。