【摘 要】
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目的:脂肪干细胞（adipose stem cells,ASCs）移植作为一种细胞疗法在组织修复、内分泌调节、免疫调节等领域得到了广泛的研究和应用。但在人和其他动物体内,ASCs的性能都不是恒定的,而是在不同组织以及不同生理状态下发生变化,使得ASCs的治疗效果表现出不稳定性,从而限制了ASCs的临床应用。哺乳动物的脂肪组织主要分为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）,两者具有几乎完全不
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目的:脂肪干细胞（adipose stem cells,ASCs）移植作为一种细胞疗法在组织修复、内分泌调节、免疫调节等领域得到了广泛的研究和应用。但在人和其他动物体内,ASCs的性能都不是恒定的,而是在不同组织以及不同生理状态下发生变化,使得ASCs的治疗效果表现出不稳定性,从而限制了ASCs的临床应用。哺乳动物的脂肪组织主要分为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）,两者具有几乎完全不同的生物学特征和功能。大量研究表明不同组织来源的脂肪干细胞存在显著的异质性,我们前期的研究也证实体外分离培养的WAT来源的脂肪干细胞（W-ASCs）和BAT来源的脂肪干细胞（B-ASCs）在成脂分化、线粒体活性等方面也有显著的差异,但W-ASCs和B-ASCs异质性的影响还缺乏体内移植研究的证据。课题组之前的研究中还发现,W-ASCs移植对衰老小鼠具有显著的抗衰老和减重效应,那么B-ASCs移植对自然衰老小鼠是否具有相同效果?B-ASCs和W-ASCs的移植对自然衰老小鼠抗衰老及减重的效果有没有差异?导致这些差异的分子机制又是什么?因此,本研究旨在比较B-ASCs和W-ASCs抗衰老以及衰老相关肥胖的效果的差异并初步挖掘差异产生的机理,厘清这些问题将为ASCs的基础和临床应用中在组织来源的选择上提供理论基础。方法:（1）ASCs的分离和培养:取小鼠腹股沟的WAT和肩胛骨的BAT,剪碎后使用胶原酶消化过滤得到单细胞悬液,通过差速贴壁法分离得到ASCs,根据BAT特异性高表达UCP1、成纤维细胞形态以及间充质干细胞的表面标记鉴定组织和细胞。（2）将3-5代的W-ASCs和B-ASCs通过腹腔注射的方式移植到衰老小鼠,对照组注射等量的PBS,记录4周内的体重和进食。（3）4周后通过眼球取血、离心后获得血清,然后处死小鼠,称量腹部脂肪的重量和肝、肾、脾的重量。（4）取小鼠肝脏组织、腹部脂肪组织进行组织固定、石蜡切片和HE染色,取小鼠肝脏组织进行冰冻切片和油红染色,观察脂肪组织脂滴大小,肝脏组织病理状态。（5）分离培养小鼠腹部脂肪组织ASCs,使用MTT法检测ASCs增殖能力,通过诱导分化和染色检测成脂、成骨分化能力,通过β-半乳糖苷酶染色的方法检测干细胞的衰老。（6）使用ELISA试剂盒检测小鼠血清衰老相关酶和激素的水平,使用全自动生化分析仪检测小鼠血清血糖、血脂水平,通过Lumiex系统检测血清炎症因子水平。（7）通过二代测序平台对W-ASCs、B-ASCs以及各组小鼠腹部脂肪进行转录组测序,对所有差异表达的基因和高表达的差异基因进行蛋白注释和功能聚类分析。（8）使用线粒体探针检测各组小鼠腹部脂肪细胞的线粒体活性,通过荧光定量PCR的方法验证转录组中的基因。（9）通过流式细胞术检测小鼠腹部脂肪组织免疫细胞的丰度。（10）通过Graph Pad Prism软件选择t检验、单因素方差分析或多因素方差的统计方法进行数据分析,转录组数据使用R语言分析。结果:（1）从BAT和WAT成功分离并培养了B-ASCs和W-ASCs。（2）移植的B-ASCs和W-ASCs成功定位于腹部脂肪组织,且没有导致肝肾功能的损伤。（3）从体重、脂代谢、干细胞特性、血清激素和酶的水平来看,B-ASCs和W-ASCs移植均在一定程度上抑制了衰老相关的肥胖病改善了一些衰老的表征,且W-ASCs的效果优于B-ASCs。（4）B-ASCs高表达多个线粒体基因和脂肪水解的基因如Apoe、Lpl,主要与产热和脂肪消耗有关;W-ASCs高表达一些如Col1a、F3等一些与免疫调节的基因。（5）B-ASCs移植后,衰老小鼠腹部脂肪表达上调的基因主要与产热、碳代谢等有关,下调的基因主要与细胞骨架、细胞连接等有关;W-ASCs移植后,衰老小鼠腹部脂肪表达上调的基因主要脂肪酸代谢有关,下调的基因主要与T细胞分化有关。（6）移植B-ASCs使得小鼠腹部脂肪产热显著增加;与B-ASCs相比W-ASCs移植显著降低了衰老小鼠腹部脂肪组织CD8+T细胞和B细胞的丰度,W-ASCs移植组小鼠的炎症水平也低于B-ASCs移植组。结论:（1）B-ASCs和W-ASCs均具有抑制衰老相关肥胖并改善衰老相关的表征的作用。（2）来自不同脂肪组织的ASCs具有不同的潜能和效果,与B-ASCs相比,W-ASCs移植更适合作为一种抗衰老和衰老相关肥胖的策略。（3）组织来源的异质性决定了ASCs作用效果的差异,从机理上来说B-ASCs移植主要发挥了产热的作用,而W-ASCs移植主要发挥了免疫抑制作用。
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