卵形鲳鲹中白细胞介素IL-17A的克隆、鉴定及免疫应答的研究

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白细胞介素17亚家族(intereukin-17,IL-17)是一类重要的促炎细胞因子。本研究中,我们以卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为研究对象,对白细胞介素IL-17A(TroIL-17A)进行了基因克隆,并对其序列特征、抗菌及蛋白功能进行了研究。结果如下:(1)TroIL-17A开放阅读框包含426 bp,蛋白质编码包含142个氨基酸残基,其中含有23个氨基酸残基的信号肽。TroIL-17A与人、小鼠等哺乳动物及其它硬骨鱼的IL-17A所编码的氨基酸序列具有19.01%-76.43%的相似性,其中,TroIL-17A与硬骨鱼中鮸鱼(Miichthys miiuy)的IL-17A序列同源性最高,为76.43%,与硬骨鱼中草鱼的同源性最低,为33.33%;而与人类IL-17A序列仅有19.01%的同源性。系统发育树的结果表明TroIL-17A与同属于鲈形目的鮸鱼和欧洲舌齿鲈亲缘关系最近。(2)qRT-PCR的结果表明,TroIL-17A在健康卵形鲳鲹的肝、脾、头肾、皮肤、肌肉、胃、肠、鳃、脑、心脏和血11个器官中均有表达,其中在免疫器官肝、头肾、脾中表达量最高。在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的感染下,TroIL-17A在肝脏和头肾中的表达量均显著上调;因此,免疫基因TroIL-17A是机体免疫调控的重要免疫因子。(3)在卵形鲳鲹中过表达TroIL-17A可以显著抑制哈维氏弧菌对鱼体的感染;而干扰TroIL-17A表达后,哈维氏弧菌感染量显著性增多。说明过表达TroIL-17A能增强机体免疫力,显著提高卵形鲳鲹抗菌能力,而干扰TroIL-17A的表达后,卵形鲳鲹更易于受细菌等外界病原体感染。(4)亚细胞定位实验表明TroIL-17A在整个细胞中均有表达。利用pET-32a(+)/E.coli BL21(DE3)表达系统对TroIL-17A进行重组表达,经镍离子柱亲和层析纯化,可获得电泳纯的TroIL-17A蛋白,并制备抗体效价高的多克隆抗体。对蛋白功能进行研究,结果表明该蛋白能诱导外周血白细胞(PBL)的迁移和促进头肾淋巴细胞(HKL)的细胞增殖;同时,重组蛋白rTroIL-17A可以显著促进肾细胞中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α基因的表达。因此TroIL-17A在趋化外周血白细胞、增殖淋巴细胞、调节免疫细胞因子等方面均发挥重要的作用。综上所述,本研究表明卵形鲳鲹白细胞介素IL-17A具有趋化外周血白细胞、增殖淋巴细胞、调节其他细胞因子的功能,可以显著增强卵形鲳鲹抵御细菌感染的能力。本研究为硬骨鱼类免疫因子相关研究奠定了基础,同时为卵形鲳鲹的疾病防控提供了新的思路。
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