Cytophaga hutchinsonii是一株来源于拟杆菌门的好氧革兰氏阴性菌,能够高效和彻底的降解结晶纤维素。但是Chutchinsonii在降解纤维素时既不大量分泌游离的纤维素酶也不产生纤维小体结构。研究表明C.hutchinsonii在降解纤维素时需要菌体与纤维素直接接触,并且大部分的纤维素酶活都是细胞偶联的。研究人员推测C.hutchnsonii在降解纤维素时可能采取一种新颖的纤维素降解机制。这种降解机制可能大致如下:细胞表面纤维素吸附蛋白负责引导菌体吸附在纤维素上,再通过外膜上的某些蛋白把纤维素链剥离出来并通过外膜运送到周质空间,由周质空间的蛋白进行降解。在纤维素降解过程中,细胞外膜蛋白和周质空间蛋白可能发挥着重要的作用。DegQ 是一个 htrA（high temperature requirement A）家族蛋白,广泛存在于各种生物中,它一般定位于周质空间,通过降解或复性未正确折叠的蛋白来控制细胞外膜和周质空间的蛋白质质量。本实验室的研究数据表明DegQ的缺失会导致C.hutchnsonii不能正常利用纤维素,说明了C.hutchins C.中DegQ重要的生理功能。但是人们对于C.hutchinsonii中甚至是拟杆菌门中的DegQ的性质几乎没有研究。为了进一步认识Chutchinson.中DegQ发挥的作用并且丰富人们对于拟杆菌门DegQ性质特点的了解,本文在大肠杆菌中异源表达Chutchinsonii.的ChuDegQ,对得到的活性蛋白的性质进行了分析研究。虽然研究人员已经推测C.hutchnsonii的外膜蛋白在纤维素降解中发挥着重要作用,但是近年来只鉴定到CHU₁276、CHU₁277、CHU₀170、CHU₃220等外膜蛋白影响C.hutchinsonii的纤维素降解。本文发现了又一个外膜蛋白—肽聚糖相关脂蛋白（Pal）影响了C.hutchins C.降解纤维素结晶区。同时我们也对chu₁276、chu₁277的下游基因Hp₄的基因功能进行了研究。具体研究内容以及取得的结果如下:1.huDegQ的性质研究ChuDegQ 由 483 个氨基酸组成,含有保守的 chymotrypsin-type serine protease,PDZ1,和PDZ2三个结构域,与来源于大肠杆菌(Escherichiacoli的EcDegQ序列一致性达到42%。EcDegQ是一个已经报道的同时具有蛋白酶活性和分子伴侣功能的双功能蛋白。为了研究ChuDegQ的性质,我们在E.coli（BL21）中异源表达ChuDegQ并且得到大量有活性的蛋白。以BSA为底物检测ChuDegQ的蛋白酶活性发现其最适反应温度为50 °C左右,最适反应pH为8.5左右。以lysozyme为底物检测ChuDegQ的伴侣活性发现ChuDegQ可以阻止被DTT变性的lysozyme的聚集。以MalS为底物,发现ChuDegQ帮助复性变性MalS的能力是自发复性的4倍。ChuDegQ所表现出的降解变性蛋白BSA的能力（蛋白酶功能）和阻止变性lysozyme聚集以及复性MalS的能力（伴侣功能）与已经报道的EcDegQ类似。ChuDegQ也是一个同时具备蛋白酶活性和分子伴侣功能的htrA家族蛋白。进一步研究ChuDegQ的蛋白酶性质发现其只能降解变性的BSA而不能降解未变性的BSA,当把变性BSA和未变性BSA混合在一起时,ChuDegQ通过特殊的识别机制能够识别变性BSA并降解。进一步研究ChuDegQ的伴侣性质发现其可以阻止lysozyme的聚集保护lysozyme的酶活,但是对于已经聚集的lysozyme,ChuDegQ并不能恢复其活性。研究表明EcDegQ的一个重要的特点是可以形成三聚体、十二聚体、二十四聚体等不同的聚合形式。长期以来,人们一直认为十二聚体或者二十四聚体也称为笼形结构是EcDegQ执行蛋白酶功能和分子伴侣功能的前提条件。直到2012年,Kim等发现三聚体形式的EcDegP（DegQ的同源蛋白）具有正常的蛋白酶活力,但是DegQ是否也是如此仍然未知。通过添加不同浓度的变性lysozyme,SEC检测到了 ChuDegQ的三聚体形式和笼形结构形式。我们通过控制底物lysozyme的浓度以及点突变两种方式得到了 ChuDegQ的三聚体形式。我们检测三聚体酶解变性蛋白质的能力发现,三聚体具有和笼形结构基本一致的酶活力,也就是说笼形结构对于ChuDegQ降解变性蛋白并不是必须的,但是三聚体在降解变性蛋白时伴随着严重的自降解。我们检测三聚体形式的ChuDegQ的类伴侣性质发现其可以阻止lysozyme的聚集,但是随着lysozyme浓度的升高三聚体所展示出类伴侣功能会弱于笼形结构。我们同时以MalS为底物检测了三聚体和笼形结构复性MalS的能力发现三聚体的分子伴侣能力是笼形结构的35%左右。由此,我们发现三聚体的ChuDegQ既可以阻止变性lysozyme的聚集,也可以恢复MalS的活力,所以三聚体形式的ChuDegQ具有分子伴侣的功能。这是首次报道分析来源于拟杆菌门的DegQ的蛋白性质,丰富了人们对于拟杆菌门htrA蛋白功能的认识。DegQ三聚体的蛋白酶活力和分子伴侣功能并没有被完整分析过。本节以检测了三聚体的蛋白酶活力说明了 DegQ的三聚体具有和笼形结构基本一致的蛋白酶活力。同时三聚体形式ChuDegQ可以阻止变性lysozyme的聚集也可以复性MalS的活力,说明三聚体形式具有分子伴侣功能。DegQ检测到笼形结构,但是形成的原因还未知。本节为解释DegQ形成笼形结构提供了依据,因为相比三聚体形式,笼形结构具有更强的分子伴侣功能且更加稳定在降解底物时基本不发生自降解。2.C.hutchinsonii 肽聚糖相关脂蛋白ChuPal的功能及其对纤维素降解的影响来源于C.hutchinsonii的pal编码一个外膜肽聚糖相关脂蛋白（outer membrane peptidoglycan associated lipoprotein,Pal）。生物信息学分析发现ChuPal除 了具有保守的OmpA_C-like结构域之外,还具有其他已报道的Pal没有的TPR（tetratricopeptide repeats）和PD40结构域。TPR可能和蛋白复合体的调节有关,PD40是一个WD-40类似结构域,和细胞分裂、mRNA修饰有关。这两个结构域可能赋予了 ChuPal更多的功能。利用同源重组的方法敲除C.hutchinsonii的pal并检测了突变株△pal的纤维素降解能力。分析C.hutchinsonii在葡萄糖中的生长情况发现,△pal可以在无机培养基Stainer中正常生长,但是在有机培养基PY6中△pal延滞期变长且最终生物量少于野生型,而在PY6中添加1g/LN03-（PY6K）恢复了△pal的正常生长能力,说明pal的缺失影响了C.hutchinsoni 在有机培养基PY6中的生长。在以无定形纤维素（RAC）为唯一碳源时,△pal的生长速率和最终生物量都和野生型基本一致,但是在以纤维素（Avicel）为唯一碳源时,△paal不能正常生长且最终生物量远少于野生型。同时我们检测了纤维素的利用率发现在培养51小时之后野生型可以利用81%的Avicel而△pal只能利用12%的Avicel。这些结果说明pal的缺失影响了C.hutchinsonii 降解结晶区纤维素。我们进一步用X光衍射（X-ray diffraction,XRD）检测Avciel的结晶度发现野生型处理完的Avicel结晶度从65.1%降低到57.4%,但是△pal处理完的Avicel结晶度从65.1%提高到70.7%,说明△pal主要利用Avicel的无定形区。同时,我们用扫描电镜观察了菌体在滤纸上的排列情况,发现野生型整齐的排列在滤纸纤维的表面,但是△pal只是生长在滤纸纤维的沟壑中。洗去菌体之后发现,野生型降解的滤纸纤维表面光滑平整,但是△pal生长的滤纸纤维表面粗糙呈沟壑状。结合之前的结果,我们推测这种沟壑状的表面可能是由于△pal只能利用纤维素的无定形区引起的。检测C.hutchinsonii的纤维素酶活,我们发现pal的缺失导致C.hutchinsonii细胞表面的纤维素内切酶酶活降低60%,细胞表面的β-葡萄糖苷酶酶活降低了30%,但是胞内的纤维素酶活基本没有受到影响,说明pal的缺失只影响了细胞表面的纤维素酶活,推测△pal细胞外膜可能受到损伤。进一步检测C.hutchinsonii对于一些有毒化合物的敏感性,我们发现△pal对于有毒化合物更加敏感,说明外膜的渗透性发生改变。提取外膜蛋白SDS-PAGE发现一些外膜蛋白的总量减少。同时我们检测了C.hutcinsonii的囊泡分泌情况发现△pal分泌的囊泡总量是野生型的六倍,并且Apal囊泡蛋白种类远远比野生型丰富。对于有毒化合物的敏感性,外膜蛋白以及囊泡和囊泡蛋白的分析表明pal的缺失导致C.hutchinsonii外膜完整性受损。CHU₃220是定位于外膜上的影响C.hutchinsonii纤维素结晶区降解的关键蛋白,我们进一步用Western Blot检测CHU₃220的定位发现△pal从外膜泄露的CHU 3220几乎都储存在胞外囊泡中,可能无法正常执行其功能,这可能也是△pal不能正常降解纤维素结晶区的原因。本节发现了一个新的外膜肽聚糖相关脂蛋白Pal影响了C.hutchinson i降解纤维素结晶区,这是首次报道的肽聚糖相关脂蛋和纤维素降解有关,丰富了人们对于肽聚糖相关脂蛋白功能的认识。同时,本节也说明了外膜完整性在C.hutchinsonii纤维素结晶区降解中发挥的重要作用,为认识C.hutchinsonii纤维素降解机制舔砖加瓦。3.未知功能蛋白基因Hp₄的研究Hp₄是纤维素降解关键基因Hp₁、Hp₂和p₃的同向下游基因。为了研究Hp₄的基因功能,我们通过同源重组敲除Hp₄之后发现AHp 4能够正常在软琼脂上滑动但是不能降解滤纸,说明Hp₄也是一个纤维素降解的关键基因。我们在Stainer固体平板中加入0.1%的葡萄糖之后发现AHp₄恢复了降解纤维素的能力。我们分析0.1%的葡萄糖在△Hp₄降解纤维素时所起的作用发现经过0.1%的葡萄糖培养基诱导的△Hp₄仍然不能降解纤维素。但是在滤纸降解实验中扩大△Hp/4的接种量发先△Hp₄恢复了降解纤维素的能力。所以我们推测0.1%的葡萄糖的作用可能是促进△Hp₄菌体最初的生长和累积。已有的研究表明Hp₄的上游基因Hp₁、Hp₂和Hp₃都是纤维素降解的关键基因。我们经过生物信息学分析发现,Hp₁-Hp₄可能是一段在噬纤维菌中比较保守的序列。实验结果表明加大滤纸降解实验的接种量之后,△Hp₁、△Hp₂、△Hp₃均能恢复降解纤维素的能力。由此我们推测Hp₁-lp₄是一段在C.hutchinsonii的纤维素降解中发挥着关键作用基因,它们的缺失可能影响了C.hutchinsonii菌体最初的生长和积累。