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家禽细菌感染性疾病防治过程中常需使用抗菌药物,而杀菌型抗菌药往往诱导革兰氏阴性菌释放内毒素。内毒素、抗菌药物皆可诱发肝损伤,二者共同刺激致肝损伤的病理演变规律及药物修复机理亟待探明。本文在内毒素、恩诺沙星单独诱发鸡肝细胞损伤基础上,建立内毒素与恩诺沙星联合诱发新型复合式肝细胞损伤模型,并藉此研究其病理发生发展及复方甘草酸单胺的保护作用及机理。主要研究内容和结果如下：1鸡肝细胞分离及原代培养方法的建立采用半原位两步灌流法,对40-50日龄的海蓝公鸡进行肝细胞分离,台盼蓝拒染法计算肝细胞存活率和细胞总数。肝细胞以5×105 cell/ml接种于6孔细胞培养板,每孔3ml,含10%胎牛血清Williams’ medium E培养基中,CO2培养箱培养。观察细胞形态,测定不同培养阶段细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力。结果显示,肝细胞存活率≥95%,肝细胞产量为(4.1±0.2)×108cell/肝；培养48 h至144h,细胞上清液中LDH活力在低水平下保持稳定,细胞可维持良好的生长状态达7天以上。2 LPS联合恩诺沙星诱导鸡肝细胞损伤体外模型的建立2.1 LPS、恩诺沙星致肝细胞损伤剂量的筛选取上述分离培养48h肝细胞,进行以下实验。LPS组分别用浓度为0(对照)、10、20、30、40、50、60、80、100μg/ml的LPS损伤肝细胞(n=3)；恩诺沙星组分别用浓度为0(对照)、100、120、140、160、180、200、220、240μg/ml的恩诺沙星损伤肝细胞(n=3)。24h后,检测肝细胞存活率,上清液ALT、AST活性,筛选致肝细胞损伤的较佳剂量。结果显示：与对照组相比,随LPS、恩诺沙星浓度增加,肝细胞存活率与ALT、AST呈剂量依赖性下降和上升。其中,10、20、30、40、50μg/ml的LPS组肝损伤不明显,60、80、100μg/ml LPS组肝细胞存活率极显著降低(p<0.01),ALT、AST活性极显著升高(p<0.01)；100、120、140、160μg/ml的恩诺沙星对肝细胞损伤不明显,而180、200、220、240μg/ml恩诺沙星肝细胞存活率极显著降低(p<0.01),ALT、AST活性极显著升高(p<0.01)。故确定LPS剂量60μg/ml、恩诺沙星剂量180μg/ml为各自致肝细胞损伤最佳剂量。2.2 LPS联合恩诺沙星致鸡肝细胞体外损伤模型的建立在2.1基础上,取正常培养48h的肝细胞,进行LPS联合恩诺沙星致肝细胞损伤相互影响的研究。用含0(对照)、30+40、30+60、30+80、30+100、30+120μg/ml LPS+恩诺沙星的生长培养液换液(n=3),培养24h后,检测肝细胞存活率,上清液ALT、AST活性。结果显示：与对照组相比,随LPS中添加的恩诺沙星剂量的增加,肝细胞损伤程度相应加大。其中30μg/ml LPS+80μg/ml,恩诺沙星使肝细胞存活率下降50%,ALT、AST活性极显著升高(P<0.01),故确定该组合浓度作为新型复合式肝细胞损伤最佳造模剂量。3复方甘草酸单胺对LPS联合恩诺沙星致肝细胞损伤的保护机理研究取培养48h肝细胞,对照组：生长培养液换液(n=3)。模型组：含30+80μg/ml LPS+恩诺沙星的生长培养液换液(n=3)；治疗组：以30+80μg/ml LPS+恩诺沙星致肝细胞损伤24h后,用含CAG浓度为25、50、100、200、400μg/ml的生长培养液换液(11=3)。各组换液处理后均继续培养24h,进行以下试验：3.1 复方甘草酸单胺对肝细胞保护和抗氧化作用 检测肝细胞培养上清液和匀浆液中ALT、AST、SOD、GSH、MDA等生化指标的含量及肝细胞存活率来研究复方甘草酸单胺对LPS联合恩诺沙星诱导的肝细胞损伤的保护和抗氧化作用。结果显示：复方甘草酸单胺可抑制LPS联合恩诺沙星损伤引起的ALT、AST活性和MDA含量的升高(p<0.05),显著提高SOD、GSH及肝细胞存活率(p<0.05)。该结果表明：复方甘草酸单胺对鸡肝细胞有保护作用,该保护作用可能与其抗氧化,清除自由基能力有关。3.2复方甘草酸单胺对肝细胞凋亡损伤的影响 流式细胞仪检测肝细胞早期凋亡比率,荧光定量PCR检测Caspase-3, Bax, Bcl-2, Fas mRNA表达水平。结果显示：复方甘草酸单胺可显著抑制由LPS联合恩诺沙星损伤引起的细胞早期凋亡比率增加；与对照组比较,模型组细胞Bcl-2 mRNA表达降低,Caspase-3, Box, Fas mRNA表达显著升高。复方甘草酸单胺可一定程度上减轻Bcl-2 mRNA表达下降与Caspase-3, Box, Fas mRNA表达升高。该结果表明复方甘草酸单胺可抑制肝细胞凋亡从而发挥对鸡肝细胞保护作用,其分子机制可能与其调节相关凋亡基因表达有关。