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EI注射液对两种拟痴呆模型大鼠脑能荷及PI3K/AKT信号通路的影响目的:采用双侧Meynert基底核注射鹅膏蕈氨酸(IBO)拟痴呆大鼠模型及自体血栓致多发性脑梗塞拟痴呆(MID)大鼠模型,考察EI注射液对痴呆大鼠模型学习记忆功能、脑能荷、脑病理形态学、胰岛素含量及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响,探讨EI注射液抗痴呆作用与PI3K/AKT信号通路调控脑能量代谢的关系,揭示EI注射液的抗痴呆的分子机制。实验方法:1.EI注射液安全性评价将KM小鼠根据性别及体重随机分为EI注射液雄性组、EI注射液雌性组、溶剂雄性组、溶剂雌性组,各组分别采用静脉注射给予相应药物,观察EI注射液对小鼠的急性毒性反应。将SD大鼠根据体重及开场实验运动时间随机分为EI高剂量(2mg/kg)、EI低剂量组(1mg/kg)、溶剂组及空白组,各组分别采用静脉注射给予相应药物,连续8天;通过爬杆实验,开场实验及Morris水迷宫实验检测各组大鼠的行为学;采用全自动血液分析仪对各组大鼠进行血常规检测;采用全自动生化分析仪对各组大鼠进行血生化检测。2.EI注射液抗痴呆作用及机制研究2.1模型建立及干预采用双侧Meynert基底核注射IBO建立拟痴呆大鼠模型,采用自体血栓注射建立MID拟痴呆大鼠模型。大鼠造模成功后,IBO拟痴呆模型大鼠分为模型组、安理申组、EI高剂量组(2mg/kg)、EI低剂量组(1mg/kg)及假手术组,MID模型大鼠分为即模型组、安理申组、喜得镇组、EI高剂量组(2mg/kg)、EI低剂量组(1mg/kg)及假手术组。EI注射液静脉注射2ml/kg,1次/d,连续干预8周。2.2有效性评价采用Morris水迷宫法,考察EI注射液对两种模型大鼠行为学的影响,评价EI注射液对模型大鼠学习记忆功能的影响;采用刚果红染色法,考察EI注射液对两种模型大鼠脑内β淀粉样蛋白沉积及锥体细胞的影响。2.3脑能荷的测定采用HPLC法,测定EI注射液对两种模型大鼠脑组织ATP、ADP、AMP含量,计算脑能荷,并分析其对拟痴呆大鼠模型脑能荷的影响。2.4.PI3K/AKT信号通路相关指标的检测采用ELISA法,考察EI注射液对两种模型大鼠脑组织胰岛素含量的影响;采用Western blot法,考察EI注射液对两种模型大鼠脑内PI3K、AKT、p-PI3K,p-AKT蛋白表达水平的影响。实验结果:1.EI注射液安全性评价小鼠急性毒性实验结果表明,EI注射液给药后,14d内各组小鼠精神、毛发及运动状态正常,各组小鼠体重、摄食量无明显影响(P>0.05),无明显不良反应,小鼠均无死亡。正常大鼠行为学实验结果表明,爬杆实验显示各组评分相比无明显差异,开场实验结果表明,除EI高剂量组大鼠相较于假手术组的运动时间明显降低(P<0.05),其余各组运动时间与运动距离无明显差异(P>0.05);Morris水迷宫结果显示,除EI低剂量组相较于溶剂组大鼠的空间探索中进入平台象限的时间明显延长(P<0.05),其余各组训练第5d逃避潜伏期、进入平台象限的时间和进入平台象限的次数无明显差异(P>0.05);正常大鼠血液检测结果显示,各组血常规指标及血生化指标也无明显差异(P>0.05)。2.EI注射液对两种拟痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响2.1EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠学习记忆功能的影响Morris水迷宫定向航行检测结果表明,与假手术相比,模型组大鼠训练第1d、第2d、第3d、5d逃避潜伏期明显延长(P<0.01),与模型组相比,EI注射液高剂量组第2d、第5d逃避潜伏期明显缩短(P<0.01),EI注射液低剂量组第2d、第4d、第5d逃避潜伏期明显缩短(P<0.01);空间探索实验结果显示,模型组大鼠相较假手术组,穿越平台象限时间明显缩短(P<0.05),穿越平台次数、穿越平台区域次数明显减少(P<0.05),与模型组相比,EI注射液高、低剂量组大鼠穿越穿越平台象限时间明显延长(P<0.05);EI注射液各剂量组穿越平台次数和穿越平台区域次数虽然有增加趋势,但无统计学意义(P>0.05)。2.2EI注射液对MID模型大鼠学习记忆功能的影响Morris水迷宫定向航线结果表明,与假手术相比,模型组大鼠训练第1d、第3d、5d逃避潜伏期明显延长(P<0.01),与模型组相比,EI注射液高、低剂量组第1d、第3d、第5d逃避潜伏期明显缩短(P<0.05);空间探索实验结果表明,模型组大鼠相较假手术组,穿越平台次数、穿越平台区域次数明显减少(P<0.05),与模型组相比,EI注射液高剂量组大鼠穿越平台次数、穿越平台区域次数明显增多(P<0.05);EI注射液各剂量组平台象限停留时间有延长趋势,穿越平台象限次数虽然有增加趋势,但无统计学意义(P>0.05)。3.EI注射液对两种拟痴呆模型大鼠脑内β淀粉样蛋白沉积及锥体细胞的影响3.1EI注射液对IBO拟痴呆大鼠脑内β淀粉样蛋白沉积及锥体细胞的影响刚果红染色结果显示,模型组海马CA1区及皮质区相较于假手术组染色较深,分布广,存在淀粉样蛋白沉积,分布散乱,锥体细胞固缩、排列紊乱疏松;EI注射液高、低剂量组CA1区及皮质区见少量淀粉样蛋白沉积,染色结果变浅,分布局限,锥体细胞排列较整齐。3.2EI注射液对MID拟痴呆大鼠脑内β淀粉样蛋白沉积及锥体细胞的影响刚果红染色结果显示,模型组海马CAI区及皮质区相较于假手术组染色较深,淀粉样蛋白分布散乱,锥体细胞有固缩、排列较疏松;EI注射液高、低剂量组CA1区及皮质区染色变浅,可见少量淀粉样蛋白沉积,分布较少,锥体细胞排列较整齐。4.EI注射液对两种拟痴呆模型大鼠脑能荷的影响4.1EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠脑能荷的影响与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中ATP、ADP含量有降低的趋势(P>0.05),AMP含量有升高趋势(P>0.05),能荷有降低趋势(P>0.05);与模型对照组比较,EI注射液高、低剂量组大鼠脑组织中ATP、ADP含量有升高趋势(P>0.05),AMP含量有降低趋势(P>0.05),能荷有升高趋势(P>0.05),提示EI注射液对该模型脑能荷无明显影响。4.2EI注射液对MID模型大鼠脑能荷的影响与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中ATP、ADP含量明显降低(P<0.05),AMP含量明显升高(P<0.01),能荷明显降低(P<0.05);与模型对照组比较,EI注射液高剂量组大鼠脑组织中ATP、ADP含量明显升高(P<0.05),AMP含量明显降低(P<0.05);EI注射液低剂量组大鼠脑组织中ATP含量明显升高(P<0.05),ADP有升高趋势(P>0.05),AMP有降低趋势(P>0.05),但无统计学意义(P>0.05);EI注射液各组大鼠脑组织中能荷明显升高(P<0.01)。5.EI注射液对两种拟痴呆模型大鼠脑PI3K/AKT信号通路相关指标的影响5.1EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠脑PI3K/AKT信号通路相关指标的影响与假手术组比较,模型组大鼠脑内胰岛素含量明显降低(P<0.05);与模型组比较,EI注射液高剂量组大鼠脑组织中胰岛素含量明显升高(P<0.05),EI注射液低剂量组有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05);与假手术组,模型组p-PI3K/PI3K,pAKT/AKT有降低趋势(P>0.05);EI注射液组相比于模型组,p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)。5.2EI注射液对MID模型大鼠脑PI3K/AKT信号通路相关指标的影响与假手术组比较,模型组大鼠脑内胰岛素含量有明显降低(P<0.01);与模型组比较,EI注射液高剂量组大鼠脑组织中胰岛素含量明显升高(P<0.05),EI注射液低剂量组有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05);与假手术组比较,模型组p-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT明显降低(P<0.05);给药组相比于模型组,p-PI3K/PI3K明显升高(P<0.05),EI注射液低剂量组p-AKT/AKT升高(P<0.05)。结论:EI注射液注射给药安全性良好;EI注射液能够改善两种拟痴呆模型大鼠学习记忆功能,对脑内β淀粉样蛋白沉积有良好的拮抗作用,能保护神经细胞损伤;EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠脑能荷无明显影响;但能明显提高MID模型大鼠脑能荷水平,对该模型脑能荷调控与PI3K/AKT信号通路密切相关。