论文部分内容阅读
猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度传染性、致死性疾病,具有较高的发病率和致死率。猪瘟在我国呈散发或地方性流行,严重危害我国养猪业。目前疫苗接种仍是防控猪瘟的主要方式。20世纪50年代,我国研制出的猪瘟兔化弱毒株(C株或HCLV株)是一株非常安全、有效的减毒活疫苗,该疫苗接种猪体后可以抵抗不同基因型CSFV的感染。猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)是由猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)引起的多种病症的总称。该病遍及全世界,给各个国家的养猪业造成极大的经济损失。该病导致感染猪产生严重的免疫抑制,降低猪体的抵抗力,常与CSF等其它疾病混合感染,加重对养猪业的危害。PCV2是引起PCVAD的病原体,其可感染各种年龄的猪,尤其严重危害仔猪的生长。其编码多个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF1和ORF2为两个较大的开放性阅读框,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白是PCV2的唯一结构蛋白,并且是主要的免疫原性蛋白。本研究旨在以C株为载体,采用多种策略表达PCV2 Cap蛋白,并且评价重组病毒的生物学特性和免疫原性,为研制同时抵抗CSFV和PCV2感染的二价疫苗奠定基础。本研究利用CSFV反向遗传学,采用不同策略拯救了以C株为骨架、包含PCV2 Cap基因的4株重组病毒。首先,以融合或单独表达形式表达Cap基因,分别成功获得重组病毒为rHCLV-Cap和rHCLV-2ACap。其次,我们又构建了单独表达去除核定位信号,并在氨基端引入不同分泌信号肽Cap基因的重组病毒rHCLV-usp Cap(带有泛素特异性肽酶基因的信号肽)和rHCLV-pspCap(带有催乳素基因的信号肽)。然后,用免疫荧光试验检测重组病毒Cap蛋白的表达;将拯救的重组病毒连续传代至第20代,用RT-PCR扩增插入的外源Cap基因,分析重组病毒的遗传稳定性;通过绘制生长曲线分析重组病毒在SK6细胞上的生长能力。最后,将4株重组病毒分别以耳缘静脉途径接种家兔后,评价重组病毒的生物学特性。结果表明,rHCLV-Cap和rHCLV-2ACap在细胞核中表达外源Cap蛋白,而rHCLV-uspCap和rHCLV-pspCap在细胞质中表达Cap蛋白;重组病毒连续传代20次后,插入的基因在其基因组中稳定存在并且不存在任何突变;重组病毒在SK6细胞上的生长能力与亲本病毒没有显著的差异;在接种后36 h,重组病毒引起家兔的体温升高至40.8℃并维持18 h;在接种后3 d,能够在接种重组病毒的所有家兔脾脏中检测到病毒基因组,并且可以从家兔脾脏中分离到接种的重组病毒,在分离的重组病毒基因组中可以扩增到插入的外源Cap基因,并且未发生任何突变;在接种后第10 d,接种重组病毒的所有家兔都可以产生抗CSFV中和抗体,然而只有r HCLV-uspCap和rHCLV-pspCap在加强免疫后3 w可以诱导家兔产生针对抗PCV2 Cap的特异性抗体。总之,我们采用多种策略成功构建了表达Cap基因的重组C株,进一步的研究证实,Cap基因在重组病毒基因组中具有遗传稳定性,4株重组病毒均可引起家兔产生定型热反应并在家兔脾脏中复制,并保持了C株在家兔体内的免疫原性,值得注意的是,2株表达不带核定位信号的Cap蛋白的重组病毒可以诱导抗Cap特异性抗体的产生。本研究创建了C株作为载体表达外源基因的平台,为研制能够同时预防猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗奠定了基础。