目的脑胶质瘤是中枢神经系统发生率最高的恶性肿瘤,因血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的存在以及传统抗肿瘤药物对肿瘤细胞选择性不强,导致目前脑胶质瘤的临床疗效较差,生存期短。研究发现,超声微泡能无创、可逆开放BBB;转铁蛋白受体(Transferrin receptor,TfR)在脑胶质瘤细胞膜上高表达;转铁蛋白受体结合肽(HAIYPRH)能与脑胶质瘤细胞膜TfR特异性结合。本课题首次将超声微泡和结合肽两种不同的靶向技术联合运用,超声微泡介导使药物透过BBB,在脑部定点释放;结合肽介导使药物对脑胶质瘤细胞产生选择性,从而实现高效率的脑肿瘤靶向治疗。鉴于此,本课题以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和表柔比星(Epirubicin,EPI)为工具药,评价HAIYPRH-5-FU和HAIYPRH-EPI两种复合物体外抗脑胶质瘤细胞活性;同时评价HAIYPRH-5-FU复合物超声微泡的体内靶向性及抗脑胶质瘤活性。方法在第一部分试验中,以EPI为工具药,谷氨酸为连接物,制备HAIYPRH-EPI复合物;以5-FU为工具药,6-氨基己酸为连接物,制备HAIYPRH-5-FU复合物。在第二部分试验中,主要明确复合物的抗肿瘤活性及其与TfR表达的相关性。首先采用流式细胞术检测U87与LN229脑胶质瘤细胞膜表面TfR1表达差异;然后以U87和LN229胶质瘤细胞为研究对象,采用mtt法考察各组药物对细胞增殖抑制作用,计算存活率评价细胞毒性,通过透射电镜和检测caspase3,8,9活性观察细胞凋亡,利用epi本身的荧光特性,借助荧光显微镜定性和流式细胞术半定量观察epi和haiyprh-epi细胞摄取,采用hplc-ms/ms法定量观察5-fu和haiyprh-5-fu细胞摄取。在第三部分试验中,我们通过正交设计优化处方,成功制备载haiyprh-5-fu超声微泡,测定包封率及载药量,并进行形态观察、稳定性观察、粒径、粒度分布与电位检测。在第四部分试验中,主要考察载haiyprh-5-fu超声微泡的体内靶向性及抗脑胶质瘤活性,采用立体定向技术建立大鼠ln229胶质瘤模型,通过mri和he染色验证模型制作成功,采用hplc-ms/ms法测定各组织和血液中的5-fu及haiyprh-5-fu的浓度,考察其靶向效率,并通过mri观察复合物超声微泡对脑胶质瘤的抑制作用,同时比较各组大鼠的生存期和体重。结果在第一部分试验中,我们成功制备haiyprh-epi和haiyprh-5-fu两种复合物,质谱鉴定分子量与预期一致,hplc测定其纯度分别为99.03%和99.07%。在第二部分试验中,流式细胞术检测脑胶质瘤细胞膜表面tfr1表达结果显示:u87细胞膜表面tfr1呈低表达,而ln229细胞膜表面tfr1呈高表达;细胞毒性与细胞凋亡结果显示:haiyprh-epi与haiyprh-5-fu对tfr呈低表达的u87细胞的细胞毒性和促凋亡活性较弱,而在tfr高表达的ln229细胞中则呈现明显的细胞毒性和促凋亡活性,且细胞毒性呈剂量依赖性,外源性加入25μmtf能明显加强复合物对ln229细胞的细胞毒性和促凋亡活性,而epi和5-fu在u87和ln229细胞中的细胞毒性和细胞凋亡活性无明显差别,tf的加入对该类效应也无明显影响;细胞摄取结果与细胞毒性、细胞凋亡结果相吻合,显示:主要依赖被动转运入细胞的epi或5-fu在u87和ln229细胞中的摄取无明显差别,但haiyprh-epi或haiyprh-5-fu在两种细胞中的摄取存在显著差异,两种复合物在ln229细胞中的摄取明显高于u87细胞,且外源性加入25μmtf能够显著加强ln229细胞对两种复合物的摄取。在第三部分实验中,以haiyprh-5-fu为试验药物,对制备影响较显著的4个因素进行正交试验,以包封率为指标进行评分,优选出最佳制备处方,即聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)800mg,司盘801.5ml,初乳水相体积1ml,聚乙烯醇(pva)体积45ml,并以最佳处方成功制备载haiyprh-5-fu超声微泡。采用hplc-ms/ms法测得其包封率与载药量分别为(45.87±0.71)%和(0.86±0.19)%;在形态及稳定性观察项中,冻干粉重悬于去离子水中,显微镜下微泡分布均匀,无粘连,7d时两种微泡仍分布均匀,分散度较好;malvernzatasizernanozs激光粒度分析仪检测其平均粒径与zeta电位分别为(476.3±143.2)nm和-(12.8±5.86)mv。在第四部分试验中,mri检查和he染色证实大鼠脑胶质瘤模型建立成功。荷瘤大鼠给药并进行超声辐照,于1h、2h、4h后测定组织分布和靶向效率,结果显示,5-fu超声微泡组与haiyprh-5-fu超声微泡组均呈现明显的脑部靶向性;药物处理前后通过mri观察肿瘤体积,结果提示,与5-fu组相比,同剂量的5-fu超声微泡组第21d肿瘤体积明显减小,与haiyprh-5-fu(0.5mm/kg)组相比,低(0.1mM/kg)、中(0.5mM/kg)、高(1mM/kg)浓度的HAIYPRH-5-FU超声微泡组在第14d和第21d肿瘤体积均明显减少,并呈剂量依赖性;各试验组从建模第10天起开始记录体重,与空白微泡组、5-FU(0.5mM/kg)组和HAIYPRH-5-FU(0.5mM/kg)组相比,中(0.5mM/kg)、高浓度(1mM/kg)HAIYPRH-5-FU超声微泡组大鼠体重从第28天开始出现显著性差异,且HAIYPRH-5-FU超声微泡组浓度越大体重变化越小,呈现剂量依赖性;在生存曲线中,空白对照组、空白微泡组、5-FU(0.5mM/kg)组、HAIYPRH-5-FU(0.5mM/kg)组、5-FU超声微泡(0.5mM/kg)组、低浓度HAIYPRH-5-FU超声微泡(0.1mM/kg)组、中浓度HAIYPRH-5-FU超声微泡(0.5mM/kg)组、高浓度HAIYPRH-5-FU超声微泡(1mM/kg)组的中位生存期分别为26天、24天、34天、25天、45天、49天、52天和63天。结论HAIYPRH-抗肿瘤药物复合物对TfR呈高表达的脑胶质瘤细胞呈现出明显的选择性和抗肿瘤活性,HAIYPRH-抗肿瘤药物复合物超声微泡对接种TfR呈高表达的脑胶质瘤细胞的荷瘤大鼠呈现出明显的体内靶向性和抗肿瘤活性。本课题的实施为开发新的具有临床应用前景的抗肿瘤药物提供了新的理论和试验依据。