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植物中PPR(pentatricopeptide repeats)基因家族是最大的基因家族之一,PPR基因属于细胞核基因,编码的蛋白即PPR蛋白。本实验室前期精细定位了水稻的CISC(cold-induced seedling chlorosis)基因,通过遗传互补试验确定CISC基因是一个PPR基因。本研究利用定量RT-PCR分析该基因及相关质体基因在水稻中的表达,同时进行CISC蛋白的亚细胞定位分析、叶绿体rpoB转录本RNA编辑位点分析以及CISC基因8 bp缺失序列分析。主要结果如下:1、CISC蛋白定位在叶绿体:利用构建好的GFP融合表达载体转化农杆菌,再经农杆菌侵染烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜观察发现重组载体的绿色荧光信号与叶绿素的红色荧光信号几乎是完全重叠的,结果说明CISC蛋白定位在叶绿体。2、CISC基因的表达分析:以26℃和19℃条件下水培的Dular和Nipponbare为材料,苗期和孕穗期提取不同部位的RNA,反转录合成cDNA,进行定量RT-PCR。苗期定量结果表明,与26℃条件相比,Nipponbare地上部和地下部在19℃条件下CISC的表达量都降低,而Dular地上部和地下部在19℃条件下CISC的表达量都上升。此外,在正常温度下(26℃)Dular的cisc基因的表达低于其在Nipponbare中的表达。在低温条件下(19℃)Dular的cisc基因表达不降反升。孕穗期定量结果表明,Nipponbare中,剑叶和成熟叶中CISC的表达高于剑叶叶鞘、成熟叶叶鞘、茎、穗和根部,Dular中,剑叶、剑叶鞘和成熟叶中cisc的表达高于成熟叶叶鞘、茎、穗和根部,尤其在穗中Cisc几乎没有表达。此外,与Nipponbare相比,Dular剑叶、剑叶鞘和成熟叶中cisc的表达较高,而成熟叶叶鞘中CiSC的表达较低。3、相关质体基因的表达分析:我们进一步检测了与叶绿素合成、叶绿体发育或光合作用相关的8个基因的转录水平,分别是编码两个反应中心多肽的基因(psaA和psbA),二磷酸核酮糖羧化酶大亚基(rbbcL),rRNA基因(rrn16S和rrn23S),PEP(plastid encoded RNApolymerase)基因(rpoB和rpoCl),核编码基因(CAB1)。以 Nipponbare 在 26℃和19℃下的表达变化趋势为背景对照,结果表明,与26℃条件相比,Dular中I类基因(rbcL、psaA和psbA)在19℃下表达下降(psaA和rbcL)或无变化(psbA),II类基因在19℃下表达下降(rrn16S)或基本不变(rrn23S),Ⅲ类基因(rpoB和rpoC1)在19℃下表达上升。4、Dular中rpoB转录本的RNA编辑存在缺陷:以26℃和19℃条件下水培的Dular和Nipponbare为材料,苗期提取地上部RNA,反转录合成cDNA,设计特异引物,扩增目标片段测序。测序结果表明Nipponbare和Dular的第156,182和187密码子上均发生C-U编辑,且属于部分编辑。对于Nipponbare而言,与26℃条件下的编辑相比,19℃条件下rpoB的3个密码子中C→U的编辑率有所提高。而在两个温度条件Dular中C→U的编辑率几乎是一样的。但同样是在26℃条件下Dular的编辑率要高于Nipponbare,在19℃条件下Dular的编辑率要低于Nipponbare。5、CISC基因8bp缺失序列分析:以土培的64个水稻品种为材料,我们首先在19℃条件下进行低温胁迫试验,然后取苗期叶片提取DNA,设计一对特异引物,扩增目标片段。低温胁迫试验中发现其中一些品种出现低温黄化现象,但没有像Dular那样典型的低温白化现象,进一步分析聚丙烯酰胺凝胶电泳结果我们未发现具有8碱基缺失的水稻品种。