CRISPR/Cas技术是目前最为先进的基因组编辑技术之一,在基因组编辑过程中,研究者们通常需要在基因组上造成双链断裂,然后通过细胞自身的一系列修复机制来完成基因组编辑。为了提高编辑效率,人们经常需要面对sgRNA位点筛选的问题,无论是构建稳定转染细胞系还是制作转基因动物,选择合适的编辑位点能够有效地提高科研工作者的效率。有效地预测不同sgRNA的编辑效率与脱靶效率是筛选sgRNA位点的前提,此前,本实验室已经通过在sgRNA识别位点上重组一个XhoI酶切位点,然后通过分析该位点的PCR产物被切开的比例来分析sgRNA的编辑效率。但该方法对基因组的修饰范围并不大,无法反映大片段的同源重组水平。Meg3基因是一种非常典型的母源印记基因。本研究建立了一种用于检测大片段的删除与插入的同源重组效率的技术,根据十个基于Meg3基因的sgRNA位点设计了与其相对应的十个同源重组片段,该同源片段的同源臂为2 kb,两段同源臂之间嵌入一段2.2 kb的UBC-GFP序列,此外本实验还构建了一种能够表达mCherry红色荧光蛋白的hCas9质粒,当重组片段与hCas9质粒都被转染到同一个细胞中时,该细胞既能表达红光又能表达绿光。整个基因编辑体系以小鼠胚胎干细胞R1作为研究对象,由于胚胎干细胞的转染难度较大,因此,使用流式细胞分选仪将其中既表达红光又表达绿光的细胞分选出来用以排除未转染成功的细胞对实验检测的影响。将分选出来的样品使用荧光定量PCR技术分析不同sgRNA打靶样品间基因组上UBC-GFP序列的相对拷贝数,在整个体系中基因组上UBC-GFP序列的拷贝数可以直接反映该位点的重组效率,也能一定程度上反映该位点的sgRNA的编辑效率,最终结果可以看出5’4 sgRNA、5’6 sgRNA以及3’1 sgRNA具有较大优势,其同源重组效率明显高于其他位点。为了提高构建细胞系过程中的编辑效率,本实验使用了组合sgRNA体系,并设计了相应的基因敲除质粒,该体系能够删除基因组上两个sgRNA位点之间的序列并在其中插入UBC-GFP序列。选择5’4+3’1与5’6+3’1两个组合并使用荧光定量PCR技术对其同源重组效率进行检测,最后实验结果表明5’6+3’1组合要具有一定的优势。为了提高整个过程中的同源重组效率,本实验使用了两种能够抑制NHEJ过程,但却能促进同源重组过程的小分子药物:SCR7与RS-1,在将CRISPR/Cas编辑体系对小鼠胚胎干细胞R1进行转染之后,在不同样品的培养基中分别加入SCR7、RS-1以及等体积的DMSO对细胞进行处理24 h,结果表明,相同体系下SCR7要比RS-1更具有优势。使用荧光定量PCR技术只能对编辑位点的重组效率进行检测,却不能反映其他位点的重组情况,为了进一步研究单个细胞水平的同源重组情况,本实验使用5’6+3’1sgRNA组合进行了基因敲除细胞株的构建,在使用5’6+3’1 sgRNA编辑组合对R1转染48 h之后对其中携带有红绿荧光的细胞进行纯化并继续培养。六天后细胞瞬时转染已经消失,此时使用流式细胞仪对绿色荧光的比例进行分析,SCR7也要优于RS-1,部分样品使用巴斯德口吸管对其中带有绿色荧光的克隆进行挑取并建系,每个药物处理组挑取48个克隆。最终获得了75株胚胎干细胞系,本实验一共设计了三对引物对细胞基因组的编辑情况进行分析,实验中并未鉴定到双基因位点敲除的细胞系,3’同源臂基本都完成了重组,但是5’同源臂位置则可能存在非同源末端连接现象。此外,本实验还使用5’6+3’1 sgRNA组合进行了Meg3基因敲除小鼠的构建,整个编辑体系将会删去5’6 sgRNA与3’1 sgRNA位点之间的片段然后在二者之间插入两段含有相同方向的loxp序列,两段loxp序列中间含有UBC-GFP片段。整个实验一共注射了630枚胚胎,共分为三组,注射完成后分别用SCR7、RS-1以及DMSO对胚胎进行处理,处理时间为24 h,24 h之后将已经发育到2-细胞阶段的胚胎移植入代孕小鼠体内,目前一共出生了38只小鼠,正在等待小鼠生长到5周龄进行下一步实验。