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背景:随着科技的发展及工业污染的加剧,环境污染对生殖健康的威胁日益严重。内分泌干扰化学物(endocrine disrupting chemicals,EDCs),又称环境内分泌干扰物,是指表现出拟自然激素或抗自然激素的生理作用,从而破坏其维持机体稳定性和调控作用的外源性化合物。由于EDCs在人们生产生活中的广泛存在以及它对人类生殖健康的巨大危害,现在受到了越来越多的重视。三氯生(triclosan,TCS)即为EDCs的一种,本课题组在前期的研究中表明:TCS暴露通过引起microRNA-134表达上升从而引起下游靶基因Nanog的表达下降,导致小鼠胚胎干细胞多能性的下降。但是目前关于TCS对植入前胚胎发育的影响和机制缺乏相应的研究。目的:1.利用小鼠做为模式动物来探讨miR-134在三氯生暴露对植入前胚胎发育影响中的作用及其机制。2.进一步寻找miR-134在早期胚胎中的其他靶基因及相关通路。方法:1.将植入前胚胎分别暴露于2μM,20μM,200μM三氯生染毒液中,将受胚胎1-细胞期定位d0.5,于d1.5,d2.5,d3.5,d4.5分别观察计数小鼠胚胎2-细胞、4-细胞、桑葚胚和囊胚数目。于d3.5收集桑椹胚,通过Real-Time PCR计算miRNA-134及其下游靶基因Nanog在TCS暴露后的桑椹胚中的表达量,并通过免疫荧光试验观察Nanog蛋白表达。2.通过显微注射miR-134 mimic使miR-134在小鼠受精卵中过表达,于d 1.5,d2.5,d3.5,d4.5分别观察计数小鼠胚胎2-细胞、4-细胞、桑葚胚和囊胚数目。收集各阶段胚胎,通过Real-Time PCR计算miRNA-134在植入前胚胎各阶段表达量。于d3.5收集桑椹胚,通过Real-Time PCR计算其下游靶基因Nanog在miRNA-134过表达后的桑椹胚中的表达量,并通过免疫荧光试验观察Nanog蛋白表达。3.通过“挽救策略”从反方面加以验证:利用显微注射技术在小鼠受精卵内分别注射miR-134 inhibitor及Nanog mRNA片段,随后将受精卵培养在TCS高浓度培养液中,于d1.5,d2.5,d3.5,d4.5分别观察计数小鼠胚胎2-细胞、4-细胞、桑葚胚和囊胚数目。4.通过单细胞RNA-Seq高通量测序技术对miR-134过表达后的转录组进行分析。结果:1.小鼠受精卵暴露于TCS染毒液,可致囊胚形成率显著下降(p<0.05),胚胎发育主要阻滞于桑葚胚阶段,且miR-134在桑葚胚中的表达量随着TCS浓度上升而不断上升,暴露于200μM TCS染毒液时miR-134表达量显著上升(p<0.05)。2.miR-134在小鼠胚胎2-细胞、4-细胞、桑葚胚和囊胚皆有表达,且囊胚期表达水平最高。3.miR-134在小鼠受精卵中过表达可致小鼠囊胚形成率下降(p<0.05),且胚胎发育同样阻滞于桑葚胚时期,与暴露于TCS后表型一致。4.Nanog表达量在miR-134过表达的桑椹胚中显著下降(p<0.05),在TCS染毒后的桑椹胚中也显著下降(p<0.05),且其蛋白表达量也显著下降。5.注射miR-134 inhibitor及Nanog mRNA片段可使TCS暴露后的胚胎囊胚形成率有所恢复。6.单细胞RNA-Seq高通量测序技术对miR-134过表达后的转录组进行分析:(1)miR-134高表达组与对照组相比,共鉴定出223个差异基因,其中上调基因187个,下调基因36个。(2)miR-134可能在正向调控p53类介质信号转导、调节神经元动作电位等生物过程,翻译起始因子激活、钙离子结合等分子功能,层状体、白介素-12受体复合物、线粒体外膜等细胞组分中起到作用,以上生物学事件均有可能是miR-134在早期胚胎中的作用机制。结论:本研究首次证实了 TCS暴露致早期胚胎发育阻滞,其机制为miR-134的上调引起了下游靶基因Nanog的下调,从而对胚胎发育产生了影响。通过对miR-134在早期胚胎中的功能探索,为我们进一步减少早期胚胎发育阻滞,及减少TCS的潜在生殖发育毒性提供一定的理论基础和科学依据。