麋鹿是一个经历过严重近交,但成功从最初18只奠基个体发展至3千多头的物种。麋鹿起源于中国,由于战乱天灾,19世纪末,麋鹿种群在中国本土灭绝。现存在世界各地的麋鹿都是19世纪末保存在英国乌邦寺18头麋鹿的后代。20世纪80年代,中国从英国重引入了77头麋鹿放养在北京南海子麋鹿苑(38头)和江苏大丰(39头)。麋鹿遂在中国迅速发展壮大。麋鹿种群从灭绝边缘幸存下来并逐渐膨胀,成为保护极危物种的成功典范。主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)是脊椎动物特有的多基因家族,能编码种类丰富的膜蛋白,具有呈递抗原、启动免疫应答的功能,是动物适应性免疫系统的重要组成部分。本研究以麋鹿北京种群和大丰种群共220只个体为研究对象,通过HURRAH方法分离MHC Ⅰ类、Ⅱ类基因并进行遗传变异分析,揭示了麋鹿MHC基因的遗传变异现状。主要的研究结果如下：1)建立了HURRAH分离MHC基因的方法。首先,基于通用引物(universal, U)合成生物素探针,对cDNA进行杂交(hybridization, H)分离序列,并通过带型复原(reconstitution, R)方法确认cDNA序列分离完整性!随后,通过分析(analysis, A)不同个体在基因组DNA水平的异源双链分子(heteroduplex,H)图谱,并选择复原(reconstitution, R)最简约和最复杂双链带型,以确保各座位基因组序列得以分离,并据此进一步判断座位数量。该方法简单、快速、高效,在哺乳动物中通用。2) HURRAH方法首先运用于Ⅱ类MHC基因的分离。我们共获得了10条全长cDNA序列(2条DRA,4条DRB,2条DQA和2条DQB)及其对应的10条基因组序列,并从中鉴定了9个Ⅱ类基因(DRA1、DRB1、DRB2、DRB3、 DRB4、DQA1、DQA2、DQB1和DQB2)。序列分析表明,所有Ⅱ类cDNA序列都可以编码完整蛋白,符合经典基因的特征。3)北京和大丰两个群体的分子调查结果表明,9个Ⅱ类基因在抗原呈递区都是单态的,仅DRA在其胞质区呈现二态。由此,我们获得了2个不对称的Ⅱ类MHC多基因单倍型：DRA1*O1-DRB1-DRB3-DQA1-DQB2和DRA1~*02-DRB2-DRB4-DQA2-DQB1。Ⅱ类不对称单倍型暗示了麋鹿在经历严重的瓶颈效应后,丢失了更强大的Ⅱ类单倍型(包含9个Ⅱ类基因甚至更多)而固定了2个相对较弱的单倍型(各包含5个Ⅱ类基因),潜在病原易感危机。4) HURRAH方法随后运用于Ⅰ类MHC基因的分离。我们获得了6条全长cDNA序列(F1、F12、G2、17、AF和18)和7条基因组序列(F1、F12、G2、I7、AF、I8和C1),并成功地鉴定了7个Ⅰ类MHC基因(F1、F12、G2、I7、AF、I8和C1)。通过序列特征(包括终止密码子、经典基因保守氨基酸和GC含量)和系统进化分析,本研究将7个Ⅰ类基因分为经典基因(F1、F12、G2和I7)、非经典基因(AF)和Ⅰ类假基因(18和C1)。5)北京和大丰两个种群的分子调查结果表明,4个经典的Ⅰ类MHC基因在抗原结合区都呈现出单态,而Ⅰ类非经典和假基因则呈现出不同程度的多态。在北京麋鹿种群中,AF和I8各有2条等位基因,C1则有4条等位基因。而在大丰麋鹿种群中,由于缺少AF~*01和C1~*03,AF、I8和C1基因分别是单态、二态和三态。该结果与大种群的多态经典Ⅰ类和寡态非经典Ⅰ类和假基因的多样性模式相反,为瓶颈种群的MHC平衡选择进化模型提供了证据,即在瓶颈动物种群中,平衡选择比遗传漂变更快地丢失MHC多样性,以便尽快体现具有重要功能的MHC等位基因!6)综合Ⅱ类和Ⅰ类MHC基因的分子检测结果,我们获得了9种Ⅱ类与Ⅰ类的连锁单倍型,但从经典抗原呈递功能来说,瓶颈后的麋鹿仅有两个MHC多基因单倍型：DRA1～DRB1～DRB3～DQA1～DQB2～F1～F12～G2～17(H1)andH2：DRA1～DRB2～DRB4～DQA2～DQB1～F1～F12～G2～I7(H2)。因此,我们建议对圈养麋鹿制定科学的繁殖计划,尽量增加H1/H2杂合子在子代中的数量,尽可能地提高子代的抗病能力,加强麋鹿圈养种群的生存能力。