论文部分内容阅读
目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的一种慢性进行性的中枢神经系统退行性疾病,以痴呆为主要特征,表现为记忆障碍、认知功能以及语言障碍等。AD的主要病理特征为细胞外淀粉样斑块的沉积、细胞内tau蛋白过度磷酸化导致神经原纤维缠结以及特定脑区神经元的丢失。淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）经β分泌酶、γ分泌酶切割产生可溶性APPβ（s APPβ）、不可溶性淀粉样蛋白（amyloid beta peptide,Aβ）以及APP胞内结构域（APP intracellular domain,AICD）。相比之下,α分泌酶、γ分泌酶切割APP能够裂解产生营养肽可溶性APPα（s APPα）、P3肽段和AICD。保护神经的α分泌酶与神经毒性有关的β分泌酶、γ分泌酶的调控被认为在AD的病因和发病机制中起着至关重要的作用。可溶性的s APPα被认为具有神经营养和神经保护特性,有可能起到清除Aβ神经毒性的作用。BAG（Bcl2-associated athanogene）是一个抗凋亡蛋白家族,目前由6个成员（BAG1-6）组成,所有成员都共享BAG结构域。BAG家族蛋白除了具有抗凋亡活性外,在健康和疾病中都有着独特的功能,尤其BAG3已成为许多研究的热点之一。BAG3（也称为CAIR-1或Bis）是BAG共伴侣家族的成员之一。除了BAG域,BAG3还有一个WW域、两个IPV基序和一个富含脯氨酸（PXXP）基序。通过这些基序,BAG3与Hsp22和磷脂酶C（Phospholipases C,PLC）等其他结合蛋白相互作用,参与多种细胞过程,包括凋亡、增殖、迁移和自噬。BAG3的各种功能与癌症、肌病和神经退行性病变等疾病有关。BAG3与tau蛋白磷酸化和s APPα都具有一定关联,BAG3既可以发挥选择性自噬作用清除错误折叠蛋白的磷酸化tau蛋白,又能够与s APPα相互作用参与细胞调控。BAG3介导的选择性大自噬可以作为维持细胞内稳态、应激和衰老的适应性机制,使BAG3成为未来药物干预的一个重要的靶点。本研究针对BAG3在5×FAD转基因小鼠、APP/PS1转基因小鼠大脑皮层和海马以及APPsw细胞内的表达变化、定位分布的情况,以及与Aβ是否共表达、与过度磷酸化tau蛋白的相关性进行系统性分析,并探讨过表达BAG3是否阻抑Aβ分泌以及对自噬的影响,对深入探讨BAG3与AD病理生理机制的关系具有重要意义。方法:一、采用7月龄5×FAD转基因小鼠。1、利用免疫荧光检测BAG3和Aβ在小鼠大脑皮层和海马内的共表达情况。2、利用免疫荧光检测BAG3与Neu N和GFAP在小鼠大脑皮层和海马内的定位情况。二、采用3月、6月、9月、12月APP/PS1转基因小鼠。1、利用Western blot检测BAG3蛋白水平变化。2、利用RT-PCR检测BAG3总m RNA的表达变化。3、利用Western blot检测ADAM10、β-catenin、磷酸化β-catenin（丝氨酸33位点、丝氨酸37位点）蛋白水平变化。三、细胞系采用小鼠来源神经瘤母细胞N2a细胞,以及稳定转染APP695swe基因的N2a细胞。1、用免疫荧光技术检测BAG3的表达情况。2、用Western blot检测BAG3总蛋白水平变化。3、利用RT-PCR检测BAG3总m RNA的表达变化。四、采用8月龄Rosa26-BAG3 KI转基因小鼠。利用Western blot检测Aβ和APP水解过程的蛋白表达变化。五、细胞系采用稳定转染APP695swe基因的N2a细胞及稳定转染人APP695swe基因的基础上慢病毒感染BAG3的N2a细胞（BAG3-APPsw细胞）。1、利用CCK8技术检测BAG3对细胞的保护作用。2、利用免疫荧光技术检测Aβ的表达情况。3、利用Western blot检测Aβ和APP水解过程的蛋白表达水平。4、利用RT-PCR检测APP水解酶的m RNA表达水平。5、加入β-catenin抑制剂XAV939后利用Western blot检测β-catenin和APP酶切蛋白变化情况。6、利用Western blot检测P62、LC3Ⅰ/Ⅱ、tau及磷酸化tau（苏氨酸231、丝氨酸396、丝氨酸404位点）、GSK3β和磷酸化GSK3β的蛋白表达水平。结果:一、对照组non-Tg小鼠大脑皮层和海马内BAG3在神经元胞浆中表达;5×FAD转基因小鼠大脑皮层和海马内BAG3主要在老年斑中呈花环状阳性表达。APP/PS1转基因小鼠在幼年期（3月龄）时BAG3蛋白水平和m RNA水平升高,中年期（9月龄）时BAG3蛋白水平和m RNA水平下降,ADAM10、β-catenin表达下降,磷酸化β-catenin（丝氨酸37位点）表达升高。在APPsw细胞中,BAG3蛋白水平和m RNA水平的变化趋势与体内实验一致水平均下降。二、BAG3 KI转基因小鼠大脑皮层内ADAM10蛋白水平升高,Aβ蛋白水平下降。BAG3-APPsw细胞增殖水平高于对照组;Aβ蛋白表达降低且荧光强度减弱;ADAM10蛋白水平和m RNA水平升高;β-catenin蛋白水平升高。加入β-catenin抑制剂XAV939后,ADAM10蛋白水平下降。三、BAG3-APPsw细胞P62和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白水平升高,磷酸化tau蛋白（苏氨酸231、丝氨酸396、丝氨酸404位点）蛋白水平下降。磷酸化GSK3β（丝氨酸9位点）水平上升,总GSK3β蛋白水平下降。结论:一、BAG3与Aβ在AD鼠脑内老年斑中共定位,在AD鼠脑神经元中表达降低。二、BAG3在幼龄AD鼠大脑皮层和海马中的表达增多,但在中老龄AD鼠脑内表达减少。三、BAG3过表达能够促进ADAM10的表达。四、BAG3通过上调β-catenin增加ADAM10的表达,从而促进APP非淀粉样蛋白水解过程。五、BAG3过表达能促进AD相关细胞的自噬过程。六、BAG3过表达能降低AD相关细胞tau蛋白过度磷酸化。