背景：肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一种血管壁细胞过度增殖,最终导致肺细小动脉管腔阻塞的循环疾病。低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)中最常见类型。HPH的发生、发展病理生理主要包括低氧性肺动脉收缩(hypoxic pulmonary artery vasoconstriction, HPV)和低氧性肺血管重建(hypoxic pulmonary vascular remodeling, HPVR)。我们知道HPVR最重要的病理特征是肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)增殖和肥大,然而其发生机制目前尚不清楚。线粒体融合蛋白2(mitofusin2, Mfn2)不仅是维持线粒体正常形态和调控线粒体融合的重要元素,同时也是细胞内重要的信号转导分子,特别是在细胞增殖、细胞凋亡通路中具有重要作用。研究发现Mfn2可以抑制PI3K/Akt信号通路,使线粒体外膜通透性增高,激活线粒体凋亡途径,细胞色素C大量释放,激活下游Caspase级联反应,促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells VSCMs)凋亡。Mfn2在心血管疾病中,对VSMCs增殖作用已有较深入研究,但在肺动脉高压中的研究甚少。我们有理由认为Mfn2既然在心血管疾病VSCMs增殖中发挥重要的作用,那么其对HPH中PASMCs很可能具有同样作用。目的：本研究探讨Mfn2在HPH模型大鼠肺组织表达情况及其在PASMCs增殖凋亡失衡中发挥的作用,并进一步研究Mfn2在此过程中对PI3K/Akt信号通路及线粒体凋亡途径的影响。方法：第一部分：在体动物实验(1)随机将20只SD大鼠平均分为常氧组和低氧组,低氧组大鼠每天放在氧浓度为(10士0.5)%的自制有机玻璃箱(0.8m×0.55m×0.40m)中饲养,每天连续低氧8h,共4周,常氧组在正常氧浓度(氧浓度21%)与低氧组大鼠同等饲养条件下饲养；(2)HPH模型大鼠复制成功后,通过测量大鼠肺功能、肺动脉平均压、RVHI (right ventricular hypertrophy index,右心室肥大指数)鉴定HPH模型；(3)逆转录RT-PCR及免疫印迹(Western Blot、WB)技术检测正常及HPH模型大鼠Mfn2mRNA及蛋白表达,WB技术检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)蛋白表达情况。第二部分离体细胞实验：(1)贴壁法原代培养PASMCs, a-SMA抗体免疫荧光技术鉴定原代培养的PASMCs;(2)为验证PASMCs增殖对低氧时间依赖性,本研究选择不同时间段将PASMCs放在低氧培养箱中进行低氧(氧浓度2.5%)干预,分别于常氧及低氧条件下培养6h、12h、24h、48h, MTT法检测细胞增殖,并使用WB技术检测低氧0h、6h、12h、24h、48h后PASMCs Mfn2及PCNA蛋白表达情况；(4)经以上实验筛选出PASMCs增殖最佳时间点作为后续实验低氧时间,低氧条件下使用LY294002(PI3K抑制剂)、LipofectamineTM2000转染携带pEGFPMfn2质粒过表达Mfn2两种干预方法进一步验证Mfn2在此过程中对PI3K/Akt信号通路及线粒体凋亡途径的影响,通过测定Mfn2蛋白表达检测转染效率后,再次将实验分为6组,分别为常氧组、低氧组、低氧+shNC(转染空质粒组)、低氧+shMfn2(转染携带Mfn2基因cDNA质粒过表达Mfn2组)、低氧+LY294002(PI3K抑制剂)、低氧+LY294002+shMfn2,实验结束后,分别使用MTT法和流式细胞术检测PASMCs增殖及凋亡情况,以β-actin为内参,WB技术检测PCNA、Mfn2、p-Akt、胞浆及线粒体中细胞色素C, cleaved caspase9蛋白表达情况。结果：在体动物研究：(1)低氧组大鼠肺组织Mfn2和蛋白表达较正常组降低,PCNA蛋白表达增高,且差异具有统计学意义。离体细胞研究：(1)PASMCs从低氧6h开始,MTT法检测细胞数量开始增高,并且在24h升高趋势达到最高,低氧6h、12h、24h、48h与常氧组相比细胞数量增加且差异具有统计学意义,12h与24h、48h相比细胞数量均增加并具有统计学意义,48h与24h比较增加但差异无统计学意义。PASMCs Mfn2mRNA.蛋白表达从6h开始下降,变化趋势与MTT法结果一致。PCNA蛋白表达从6h开始升高,变化趋势与MTT法结果一致。(2)转染携带pEGFPMfii2的质粒过表达Mfn2效率经WB技术检测Mfn2蛋白表达后,结果发现PASMCs转染Mfn2cDNA后,Mfn2蛋白表达与未转染及转染空载组比较表达均升高,差异具有统计学意义。转染空载组与未转染组相比无明显变化,差异无统计学意义。(3)上述结果我们筛选出最佳PASMCs低氧状态下增殖时间24h,取改点为低氧观察时间点。低氧24h组与常氧组相比,Mfn2表达下调,p-Akt(磷酸化的Akt蛋白)表达增高,激活PI3K/Akt信号通路,使更多进入细胞周期的S+G2/M期,PCNA表达增高,线粒体凋亡通路被抑制,细胞浆与线粒体内细胞色素C比值降低,cleaved caspase9蛋白表达下调,PASMCs凋亡抑制。(4)单独过表达Mfn2或单独使用LY294002干预后低氧条件下培养24h,与低氧组相比,Mfn2蛋白表达升高,p-Akt表达表达下调,PI3K/Akt信号通路被抑制,使细胞周期抑制在G0/G1明,PCNA表达下调,线粒体凋亡通路激活,细胞浆与线粒体内细胞色素C比值增高,cleaved caspase9蛋白表达增高,PASMCs凋亡增加。(5)同时过表达Mfn2及使用LY294002干预与两者单独干预比较无协同作用。结论：(1)HPH模型大鼠肺组织Mfn2及低氧状态下PASCMs Mfn2蛋白表达下调,PASMCs凋亡减少,PASMCs增殖增加。(2)在低氧状态下,Mfii2在PASMCs中表达下调后,下游PI3K/Akt信号通路活化增加,抑制线粒体凋亡途径,在一定程度上提示Mfn2在HPH血管重构发病机制中发挥重要作用。