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本工作研究了拟南芥和菘蓝SEP3直系同源基因不同剪接本以及菘蓝E类花同源异型基因IiSEP1和IiSEP2的生物学功能。拟南芥的AtSEP3基因和菘蓝的IiSEP3基因具有同样的剪接方式,可以产生全长剪接本(AtSEP3-2与IiSEP3-2)和缺少第六个外显子的可变剪接本(AtSEP3-3与IiSEP3-3),这种保守的剪接方式对植物生长过程可能具有重要的调节功能。IiSEP3-2、IiSEP3-3、IiSEP1和IiSEP2蛋白的N-末端都存在一个核定位信号KRIENKINRQVTFAKRR,它们均定位于细胞核中。对氨基酸序列进行分析,发现这几个蛋白质的C末端都有三个保守的基序,分别为SEP motifⅠ(FFQPLE)、SEP/AGL6motif(PILQIGY)和SEP motifⅡ(NNYMLGWLP),所以这几种蛋白质可能具有冗余性功能。采用qRT-PCR技术对AtSEP3-2、AtSEP3-3、IiSEP3-2和IiSEP3-3四种剪接本以及IiAP1、IiSEP1和IiSEP2基因在转录水平的表达模式进行分析,结果表明IiAP1和AtAP1存在相似的表达模式,在营养生长阶段不表达,在花序、花、花萼和花瓣中表达,且在花序中的表达水平最高;IiSEP1、IiSEP2、AtSEP1和AtSEP2在营养生长阶段不表达,但在生殖生长阶段高水平表达;IiSEP1在短角果中的转录水平最高,而AtSEP1在雌蕊中的表达水平达到峰值;IiSEP2转录本在花瓣中的丰度最高,而AtSEP2转录本在雄蕊中的数量达到峰值;IiSEP3-2和AtSEP3-2在根和茎中不表达,在叶片中表达量很低;在花器官中,SEP3-2剪接本的表达水平明显增加,IiSEP3-2在花瓣中出现峰值,AtSEP3-2在角果中丰度最高;IiSEP3-3和AtSEP3-3在根和茎中几乎检测不到信号,而在叶片中开始积累;IiSEP3-3在花瓣中的积累数量达到峰值,而AtSEP3-3在雌蕊中的丰度最高。同时,从蛋白质水平分析了AtSEP3-2、AtSEP3-3、IiSEP3-2和IiSEP3-3在不同组织和器官中的积累数量。Western blotting实验结果表明,在菘蓝的根和茎中检测不到IiSEP3-2和IiSEP3-3信号,但在莲座叶和花中可以检测到IiSEP3-2蛋白,在莲座叶、茎生叶和花中能够检测到IiSEP3-3蛋白。在拟南芥中,仅在花、雄蕊和雌蕊中能够检测到AtSEP3-2信号,而AtSEP3-3除了在根和茎中检测不到信号以外在其他组织和器官中都能够表达。以上结果表明,AtSEP3-2、AtSEP3-3、IiSEP3-2和IiSEP3-3四种剪接本具有不同的表达模式,它们在开花转变和花器官形成过程中可能具有不同的调节功能。在此基础上,利用人工miRNA(artificial miRNA,amiRNA)技术分别对AtSEP3-2和AtSEP3-3剪接本进行了沉默,分析了AtSEP3-2和AtSEP3-3在拟南芥生长发育过程中所发挥的功能。与野生型拟南芥相比,miR-sep3-2和miR-sep3-3转基因拟南芥植株在营养阶段的生长状态更加旺盛,叶片面积变大,叶片边缘呈现出明显的缺刻表型。此外,在miR-sep3-2转基因拟南芥植株中花萼和花瓣的排列方式也发生了改变。转录组测序结果表明,miR-sep3-2转基因植株中共有1116个基因的表达水平发生了变化,其中有559个基因上调,557个基因下调;miR-sep3-3转基因植株中共有1347个基因的mRNA积累水平发生了改变,其中879个基因上调,468个基因下调。进一步通过染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,ChIP)对AtSEP3不同剪接本编码产物调控的下游基因进行了分析,发现AtSEP3-2能够直接结合至AGL17、AGL20、AGL42、ARF17、CCA1、FT、GI、GRF8、LFY、SEP3、SHP1、STM、TCP3、TCP12和TT16等基因的启动子区,间接控制AGL15、AGL24、AGL96、MAF、SHP2、LHY、TCP2和TCP23等基因的转录过程;AtSEP3-3可以直接调控AGL15、AGL24、ARF17、CUC2、GI、GRF8、MAF5、SEP3、SHP1、STM和TT16等基因的表达活性,间接控制AGL17、AGL20、AGL42、FT和LHY等基因的转录过程。这些结果说明拟南芥AtSEP3基因的两种剪接本在功能上存在差异。在拟南芥中组成性表达菘蓝的IiSEP3-2、IiSEP3-3、IiSEP1和IiSEP2都可以引起早花,花器官的发育也出现异常。与野生型拟南芥相比,35S::IiSEP3-2、35S::IiSEP3-3、35S::IiSEP1和35S::IiSEP2转基因拟南芥株系不仅早花,而且呈现出矮化表型。35S::IiSEP3-2、35S::IiSEP3-3和35S::IiSEP1转基因拟南芥植株的莲座叶向上卷曲,而35S::IiSEP2转基因拟南芥植株的莲座叶并没有发生明显变化。在IiSEP3-2转基因拟南芥植株中,萼片、花瓣和雄蕊数目减少,茎生叶和花萼发育为类似心皮的结构。在IiSEP3-3转基因拟南芥植株中,萼片、花瓣和雄蕊数目减少甚至缺失,花粉不能完全发育,四轮花器官过早萎蔫,整个花呈败育状态。35S::IiSEP1转基因拟南芥株系的花在形态上也不正常,花器官会发生同源异型转变。35S::IiSEP2转基因株系的花瓣发育异常,花萼和雄蕊数量减少,花萼转变成类似心皮的结构。采用基于烟草脆裂病毒的VIGS技术沉默菘蓝中的IiSEP3-2和IiSEP3-3剪接本,可以使菘蓝的开花时间推迟,花器官的正常发育过程也被扰乱。与对照组菘蓝植株相比,用TRV-IiSEP3-2和TRV-IiSEP3-3处理后菘蓝植株的营养生长时间明显延长,花瓣和雄蕊数量减少,花药发育异常。此外,用TRV-IiSEP3-3处理后菘蓝的花萼在数量上也会减少,花瓣的形状明显改变。转录组测序结果显示,在TRV-IiSEP3-2处理的菘蓝植株中有1861个基因的表达水平发生了变化,1035个基因上调,826个基因下调;在TRV-IiSEP3-3处理的菘蓝植株中有2063个基因的表达水平发生改变,其中1289个基因被促进,774个基因被抑制。以上结果说明,IiSEP3基因与开花转变过程有关,它的剪接本被沉默以后菘蓝植株将不能从营养生长阶段正常地进入生殖生长阶段。酵母双杂交实验结果表明,IiSEP3-2与IiSEP1、IiSEP2、IiSEP4、IiSVP、和IiSHP2具有相互作用,但与IiFUL没有相互作用;IiSEP3-3与IiSEP1、IiSEP4和IiSVP能够形成异二聚体,但与IiSEP2、IiSHP2和IiFUL不能形成异二聚体。这些结果说明,IiSEP3-2和IiSEP3-3具有不同的互作蛋白,它们在功能上存在差异。综上可得,拟南芥的AtSEP3-2和AtSEP3-3能够调节不同的下游基因,参与叶片的形态建成和花器官发育过程。菘蓝的IiSEP3-2和IiSEP3-3可以和不同的蛋白质相互作用,影响开花转变和花器官发育过程。