研究背景与总体思路近年来,防治缺血再灌注损伤( Ischemia reperfusion injury, IRI)一直是组织和器官保护研究的主要方向之一。血管内皮细胞(Vascμlar endothelial cells,VEC)缺血再灌注损伤可引起内皮屏障功能障碍、血栓形成和组织水肿。研究表明,在心脏IRI过程中,内皮细胞的结构和功能异常发生时间早于心肌细胞,是心脏缺血再灌注损伤早期发生、发展的病理生理基础,其功能恢复也晚于心肌细胞。因此,保护再灌注损伤内皮细胞具有重要意义。在内皮细胞保护研究中,不少学者重视激活细胞内源性保护机制,关注焦点之一即是热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)。HSPs是细胞在生理状态下必需,应激(热休克、缺血缺氧等)状态下表达增多的一类保护性蛋白质。热休克蛋白22(Heat shock protein, HSP22)是新近发现一种小分子热休克蛋白,广泛分布于哺乳动物的各种组织中。研究显示HSP22在缺血再灌注损伤心肌细胞中具有抗凋亡,抗氧化应激和分子伴侣等生物学功能,对再灌注损伤心肌的保护作用等同于缺血预适应。但HSP22是否对缺血再灌注损伤内皮细胞具有同样的保护作用?其可能信号通路情况如何?尚有待于进一步研究。本研究,通过以建立内皮细胞缺氧/复氧模型模拟缺血/再灌注损伤,首先观缺氧/复氧损伤内皮细胞中HSP22基因表达水平的变化;其次,构建人HSP22过表达重组质粒,转染内皮细胞,通过G418筛选,获得稳定表达HSP22蛋白的内皮细胞株。在此基础上,观察HSP22对缺氧/复氧损伤内皮细胞的保护作用,并探讨其与NF-кB信号通路的关系。第1部分缺氧复氧干预对内皮细胞中HSP22基因的影响目的:探讨热休克蛋白22(HSP22)在缺氧/复氧损伤内皮细胞中的表达及其规律。方法:培养人脐静脉内皮细胞株,分为正常培养组和缺氧/复氧组,缺氧环境在密闭的缺氧盒中经一次性缺氧催化袋(它能吸收O2,产生CO2)产生,复氧置于5%CO2、37℃培养箱内。实验分为两个部分:1.观察正常及缺氧24小时后复氧0、3、6、12h,倒置显微镜下观察各组内皮细胞形态,流式细胞仪及DNA电泳检测内皮细胞凋亡。2.应用RT-PCR及Western blot法检测HSP22的表达,明确缺氧/复氧损伤对HSP22基因的表达是否具有影响。结果:1.流式细胞仪及DNA电泳检测凋亡,缺氧24 h(复氧0h)仅少量内皮细胞发生凋亡,但复氧后3、6、12h内皮细胞凋亡逐渐增加, 12h凋亡率达55.03%; 2.RT-PCR及Western blot法,HSP22在正常内皮细胞中无表达,缺氧24 h复氧0h(缺氧24 h)出现表达,复氧3 h与复氧0h比表达进一步表升高(P﹤0.05),复氧6 h达峰值(P﹤0.01),但12 h表达回落。结论:在正常内皮细胞中无HSP22蛋白表达,但缺氧/复氧应激可以诱导内皮细胞中HSP22的表达,HSP22应激表达可能对缺氧/复氧损伤的内皮细胞具有保护作用。第2部分:稳定表达人热休克蛋白22基因内皮细胞株的构建目的:构建pEGFP-N1/HSP22真核表达质粒并观察在内皮细胞中的表达。方法:RT-PCR从人MCF-7细胞中扩增HSP22基因,将HSP22基因连接到真核表达载体pEGFP-N1中,并转化DH5α,获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。用脂质体法将重组质粒转染人脐静脉血管内皮细胞。G418筛选,获得G418抗性单克隆细胞,用荧光显微镜、逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western blot检测HSP22在人脐静脉内皮细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物, HSP22基因片段长约613 bp,与预期分子量相符,测序结果证实克隆完全正确;其阳性克隆进行酶切鉴定与热休克蛋白22理论值相符。稳定转染单克隆细胞中,荧光显微镜观察到每个细胞均有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot检测到HSP22mRNA和蛋白表达。结论:成功获得稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。第3部分HSP22对缺氧/复氧致内皮细胞凋亡的保护作用的研究目的:探讨HSP22对缺氧/复氧致内皮细胞凋亡的保护作用方法:实验分为稳定表达pEGFP-N1空质粒对照组和稳定表达HSP22的pEGFP-N1/HSP22质粒组,缺氧培养24h后,分别复氧0、3、6、12h。应用流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色法、原位缺口末端标记(TUNEL)法检测各组内皮细胞的凋亡,Western blot检测各组中Caspase-3、Bcl- 2和Bax蛋白的表达。结果:流式细胞仪和TUNEL法检测显示:内皮细胞缺氧24h后不同时间复氧, HSP22过表达组较pEGFP-N1对照组内皮细胞凋亡率显著下降。Western blot结果显示(1)随复氧时间延长,两组中Caspase-3水平升高,高峰见于复氧12h,但pEGFP-N1/HSP22复氧各时间点Caspase-3水平均低于空质粒对照组;(2)缺氧复氧后pEGFP-N1/HSP22组Bcl-2水平显著高于pEGFP-N1组(p<0.05),但两组中Bax蛋白表达无变化。结论:过表达HSP22可对缺氧复氧损伤内皮细胞产生显著保护作用,机制与HSP22上调内皮细胞中Bcl- 2水平有关。第4部分HSP22对缺氧/复氧损伤内皮细胞中NF-кB转导通路的影响目的:探讨HSP22对缺氧/复氧损伤内皮细胞中NF-кB转导通路的影响及其机制。方法:实验分三组:未转染组,转染pEGFP-N1空质粒细胞组和pEGFP-N1/HSP22重组质粒细胞组,观察缺氧24小时复氧12小时内皮细胞,电泳迁移率(EMSA)检测NF-кB的表达;应用核浆分离技术和Western blot分析法检测NF-кBp65亚基在各组细胞核内的蛋白表达水平;应用Western blot分析法检测各组细胞NF-кB信号途径中,кB抑制因子-α(IкB-α)的降解以及IкB激酶IKKa的表达;免疫共沉淀检测HSP22在NF-кB激活通路里IкB-α和IKKa蛋白的关系。以HSP22抗体免疫共沉淀和Western blot法检测各组细胞中HSP22与IкB-α和IKKa蛋白的结合水平。结果:EMSA分析法显示,pEGFP-N1/HSP22组核内NF-кB活性水平显著低于对照组和pEGFP-N1组(P﹤0.05),应用核浆分离技术和Western blot分析各组NF-кB p65水平与EMSA结果一致。Western blot分析法检测各组细胞IкB-α、IKK-α,可见pEGFP-N1/HSP22组IкB-α表达水平显著升高,而IKK-α表达水平低于Control组和pEGFP-N1组(P<0.05)。应用免疫共沉淀—Western blot法检测各组细胞HSP22与IкB-α和IKKa蛋白结合水平,可见HSP22与IKK-α抗体共免疫沉淀,在pEGFP-N1/HSP22组出现特异性条带,提示HSP22抑制NF-кB激活可能是通过它与IKK-α相互作用。结论:在缺氧/复氧损伤内皮细胞中,HSP22可能通过影响IKK-α水平,升高细胞内IкB-α水平,抑制NF-кB的表达而对缺氧/复氧损伤内皮细胞发挥保护作用。