毒蛇咬伤常见于热带和亚热带地区。在非洲、亚洲、大洋洲和拉丁美洲的农村地区,毒蛇咬伤是特别突出的公共卫生问题。最近的一项研究估计:全球范围内,每年遭受毒蛇咬伤的人数超过5亿,导致25,000-125,000人死亡。在法医工作中,怀疑是蛇毒中毒的案件经常发生,确定是否是蛇毒中毒,是哪种蛇毒中毒,是解决该类案件的关键。目前,我国的蛇伤鉴定方法主要是依靠观察牙痕、症状和生化常规检查,其中牙痕是关键。但是,在实际工作中又经常会碰到没有明显牙痕的案件,这时就得凭经验通过症状和生化指标来判断是否是蛇毒中毒、是哪种蛇毒中毒,错误判断的可能性非常大,因此,我们亟需新的鉴定技术。本研究选择了中国境内常见的4种蛇毒(中华眼镜蛇毒、五步蛇毒、金环蛇毒、银环蛇毒),运用以液相色谱质谱联用技术为依托的蛋白质组学技术开展蛇毒的体内外蛋白质组学研究,既探索每种蛇毒的高丰度特征毒素蛋白,也探索蛇毒对实验动物内源蛋白质的影响,以期获得蛇毒中毒的生物标志物,为蛇伤案件的鉴定提供新方法。主要研究内容分为以下3个部分。第一部分中国境内4种常见蛇毒的体外蛋白质组学研究为了了解不同蛇毒的蛋白质丰度特征,我们将五步蛇毒、眼镜蛇毒、银环蛇毒和金环蛇毒用胰蛋白酶酶解后以基于液相色谱质谱联用的蛋白质组学技术进行检测,获得的肽段数据用Max Quant软件进行无标记定量。结果显示Metalloproteinases、C-type lectins和antithrombin是五步蛇毒中的高丰度蛋白质,它们的丰度分别为25.4%、24.6%和23.6%;cardiotoxins是眼镜蛇毒的高丰度蛋白,其丰度达到了77.1%;在银环蛇毒中,beta-bungaratoxin和short neurotoxin homolog NTL4的丰度分别为21.1%和46.6%;在金环蛇毒中,acetylcholinesterase则以39.8%的丰度居于首位。本部分研究结果表明不同蛇毒在蛋白质组成和丰度上有显著差异,可以成为法庭科学和临床医学蛇伤鉴定的基础和依据。第二部分注射蛇毒引起的大鼠血清蛋白变化为了探寻蛇毒导致的血清内源蛋白变化,我们从蛋白质组学层面考查了蛇伤时间和蛇毒剂量对血清蛋白质的影响。我们选择了SD大鼠,将4种蛇毒通过腿部肌肉注入大鼠体内,在预定的时间点收集血清,血清经预处理后用液质联用方法检测蛋白质变化,并用Peaks Studio进行i TRAQ 8Plex鉴定和定量,定量信息经聚类以寻找随时间变化表达量有逐步上调及下调趋势的大鼠蛋白。随后,这些有明显变化趋势的蛋白被进行了IPA分析(下游功能效应分析、通路分析、调控趋势变化、蛋白质相互作用网络分析)。Peaks Studio的定量结果进一步按照实验组蛋白强度与对照组蛋白强度的比值<0.7或>1.33进行筛选,以获得在各组大鼠血清中差异明显的蛋白质。结果显示五步蛇毒组大鼠的血清内源蛋白变化是本实验中最多的(83个蛋白),并且主要集中在Fibrinogen、Coagulation factor、Tropomyosin、Tubulin、Myosin等与血液凝固和细胞骨架相关的蛋白上;眼镜蛇毒高浓度组有47个蛋白发生浓度改变,且低浓度组也有28个蛋白改变了浓度;环蛇属的银环蛇毒导致的血清内源蛋白变化很少,但是在为数不多的变化了的内源蛋白中出现了与神经通路相关的蛋白。这表明不同蛇毒会导致不同的内源蛋白发生变化,相应内源蛋白的改变则可以与不同的蛇伤联系起来。在浓度变化明显的内源蛋白中,有一些蛋白在3个时间点表现出持续上调或持续下调,在对这些蛋白进行了系统的文献调查后,我们选出了Retinol-binding protein 4、L-selectin、Troponin I、Protein Z-dependent protease inhibitor作为眼镜蛇毒中毒的潜在生物标志物;Fibrinogen作为五步蛇毒中毒的潜在生物标志物;EH domain-containing protein 1作为银环蛇毒中毒的潜在生物标志物。第三部分注射蛇毒引起的大鼠肌肉蛋白变化为了探寻蛇毒对肌肉组织内源蛋白的影响,我们用蛋白质组学技术研究了蛇伤动物的肌肉组织。肌肉的蛋白质数据用Peaks Studio进行i TRAQ 8Plex鉴定和定量,并对定量信息进行了聚类,寻找上调和下调的大鼠蛋白,并对这些有明显变化趋势的蛋白进行了IPA分析。分析的主要类型包括:功能效应分析、通路分析和蛋白质相互作用网络分析。Peaks Studio的定量结果进一步按照实验组蛋白强度与对照组蛋白强度的比值<0.7或>1.33进行筛选,以获得在各组大鼠组织中差异明显的蛋白质。研究发现不同蛇毒导致的组织内源蛋白变化有明显不同,同时也发现了蛇毒成分之一的MPPA在5组大鼠伤口组织中均明显上调,该蛋白或许可以作为蛇毒中毒的外源标志物。五步蛇毒组大鼠的HBA/HBB、LEG5、FGA相对对照组及其它实验组有显著高表达,可以考虑作为五步蛇毒中毒的内源性潜在生物标志物。在银环蛇毒组,GC和GELS相对对照组表达上调,而IPKA、ACSL1、DOPD和ACADV则相对对照组表达下调,这6个蛋白有望成为银环蛇毒中毒的内源标志物。金环蛇毒组的FGA和FGB表达上调都超过了2倍,其它内源蛋白如PLMN、TF、ALB、C9和APOH相对其它4组实验也具有显著高表达,有望作为金环蛇咬伤的蛋白质标志物。在眼镜蛇毒组大鼠组织中,GELS、HSP71、ATN2和SYNPO均有显著的差异表达,可以作为潜在的标志因子用眼镜蛇咬伤的诊断。本课题运用基于质谱的蛋白质组学技术首次系统研究了中国境内常见的4种蛇毒(五步蛇毒、中华眼镜蛇毒、金环蛇毒、银环蛇毒),以及蛇毒对生物血清和组织内源蛋白质的影响,获得了蛇毒产生毒性作用的生物学通路和蛋白质调控网络,并通过对内源蛋白质浓度变化数据的严格筛选,获得了4种蛇毒中毒的潜在生物标志物,为法医蛇伤案件鉴定方法的进一步深入研究提供了新方法和新思路。