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目的:检测RTVP-1在胶质瘤中的表达;体外研究RNA干扰对人胶质瘤u251细胞株、SHG-44细胞系RTVP-1基因的沉默,探讨siRNA转染时间、转染浓度和目的基因表达之间的相关性;同时观察沉默RTVP-1基因后,在不同转染时间、转染浓度,RNA干扰对细胞生长、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法:采用免疫化学法检测胶质瘤u251细胞株、SHG-44细胞系和临床石蜡标本中RTVP-1蛋白的表达;脂质体法将针对RTVP-1基因的siRNA转染胶质瘤u251细胞株、SHG-44细胞系,运用半定量RT-PCR、Western-blot技术、流式细胞仪分别检测不同转染时间点以及不同转染浓度细胞株目的mRNA、目的蛋白表达变化,以及细胞周期变化和凋亡情况;SRB法检测细胞相对数量的变化。结果:免疫化学法检测u251细胞株和所选四个临床胶质瘤标本中均见到RTVP-1蛋白的表达,且主要表达于细胞浆;但是SHG-44细胞系中未见该蛋白的表达。随着转染时间的增加,在24小时,对RTVP-1在RNA水平沉默效应最明显,而蛋白表达的下降则在48小时最明显。不同浓度siRNA转染的u251细胞,RTVP-1mRNA表达均下降,而且随着试验浓度的升高,抑制率逐渐提高,200nM浓度下抑制率达到100%。Western-blot检测RTVP-1蛋白表达量亦随着转染浓度的增加而逐渐下降。经流式细胞仪检测u251细胞,乱序对照组细胞与空白对照组相似,细胞阻滞和细胞凋亡效应不明显。而siRNA干扰组则显示明显细胞阻滞和细胞凋亡。时间效应上,12h和24h已经看到明显的细胞凋亡,以后细胞凋亡又逐渐下降;细胞阻滞效应最大发生于24h,其G0/G1期细胞为72.1%。浓度效应上25nM和50nM的细胞阻滞效应不明显,但是已经可以看到明显的凋亡,随着浓度的增加细胞阻滞和凋亡效应亦逐渐提高,尤其是200nM组,其G0/G1期细胞为88.4%,S期细胞仅为0.1%,凋亡达到12%。不同转染时间,SRB法检测转染后的u251细胞生长明显受抑制,与空白组比较有统计学差异,而乱序对照组与空白组比较没有统计学差异。SHG-44细胞生长没有变化。RT-PCR和Western-blot均未能检测到SHG-44细胞系中RTVP-1的表达。结论:一、RNA干扰沉默RTVP-1基因后,u251细胞生长明显受抑制。SHG-44细胞生长没有变化。1.对u251细胞株,实验所选择的转染片断,在mRNA水平对RTVP-1基因实施了沉默,沉默效率较高,是有效的沉默片断。RT-PCR和Western-blot均未能检测到SHG-44细胞系中RTVP-1的表达。2.在u251细胞株中,在12、24、48、72小时四个时间点,对RTVP-1基因在mRNA水平达到最大沉默效应是在转染24小时,而引起蛋白表达的下降,则在转染后48小时最明显。3.在u251细胞株中,在25nM、50nM、100nM、200nM浓度范围内,随着siRNA浓度的增加,对目的基因的沉默效率随之增高。低浓度siRNA即可抑制目的基因的表达,siRNA对目的基因的抑制与转染浓度成正相关。Western-blot检测目的蛋白的下降亦与转染浓度成正相关。二、RNA干扰沉默RTVP-1基因后使u251细胞阻滞在G1期,S期细胞减少,细胞凋亡增加,从而引起生长抑制。三、免疫细胞化学和免疫组织化学提示SHG-44细胞系中RTVP-1不表达,u251细胞株和四个临床胶质瘤标本石蜡切片中均表达RTVP-1蛋白。