论文部分内容阅读
七鳃鳗,现存最古老的无颌类脊椎动物之一,因其独特的进化地位和免疫系统获得了关注,成为研究脊椎动物先天免疫系统、抗氧化系统起源及进化的新型模式生物,因此七鳃鳗的先天免疫防御系统中必然存在一系列与解毒及参与水生动物氧化抗菌反应的相关蛋白。本论文首次从日本七鳃鳗(Lampetra japonica)白细胞中获得了乙醛脱氢酶9(aldehyde dehydrogenase 9,ALDH9)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPx4)的同源基因,通过基因克隆、重组表达及生物信息学方法对基因进行分析预测,为更好的了解其活性奠定了基础。乙醛脱氢酶(ALDHs),能够将不同醛类氧化为相应的酸类,在内源性和外源性醛解毒过程中扮演了重要的角色。目前为止ALDH在哺乳动物及微生物中已有所研究,但其在鱼类及两栖类动物中研究较少。本论文首次克隆并原核表达了来自于日本七鳃鳗的ALDH9(Lj ALDH9)基因。LjALDH9 ORF区共1566 bp,编码521个氨基酸,理论分子量为55.68 kDa。LjALDH9蛋白含有信号肽区域(1-29)、Cys315活性位点及Aldedh结构域。除去信号肽区域其理论分子量为52.92 kDa,等电点为5.57。重组LjALDH9以包涵体形式存在,通过变性、复性及纯化对酶活性进行了测定,结果显示LjALDH9酶的最适反应pH为7.0,最适温度16-23°C,Mn2+为其激活剂。实时定量PCR表明LjALDH9在口腔腺中呈现高表达,证明了LjALDH9在七鳃鳗寄生生活阶段发挥着重要作用。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx),是一类抗氧化酶,能够减少脂质氢过氧化物、氢过氧化物和有机氢过氧化物,维持组织正常的氧化还原水平,避免DNA、蛋白质和脂质等的氧化损伤。本论文首次克隆得到日本七鳃鳗GPx4基因(LjGPx4)及其基因组DNA序列。LjGPx4 ORF区全长477 bp,编码158个氨基酸,蛋白质分子质量预测为18.06 kDa,理论等电点为7.75。酶的活性位点为硒代半胱氨酸(33 TGA),由终止密码子编码。LjGPx4完整基因组序列共6541bp,包含六个外显子及五个内含子结构。脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后发现,LjGPx4 mRNA在白细胞中表达升高,说明LjGPx4参与抗菌免疫应答,为抗氧化剂酶在无颌类脊椎动物的先天免疫反应中发挥至关重要的作用提供了实验依据。