背景前列腺癌(Prostate cancer;PCa)是最常见的恶性肿瘤之一,在男性癌症相关死亡率中占第六位。据WHO全球肿瘤流行病学统计数据显示,全球男性癌症发病率排名,PCa仅次于肺癌位居第2位。在中国,生活习惯、饮食结构西方化、人口老龄化使得PCa的发病率快速逐年上升。目前PCa临床可行前列腺根治性切除术;晚期以内分泌治疗为主,可行睾丸切除术,配合激素阻断治疗。中位缓解期为18-24个月,多进展为去势抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer;CRPC),具有高增殖性、高侵袭力,目前临床治疗方法多不理想。肿瘤细胞能够对几乎所有的靶点治疗产生适应性抵抗。这是在医疗领域中一直存在的挑战。转移性前列腺癌(Metastatic prostate cancer;mPCa)目前是无法治愈和致命的。自从1941年起由Huggins和Hodges进行的外科或医学阉割证明雄激素剥夺抑制前列腺癌,目前雄激素剥夺疗法(androgen-deprivation therapy;ADT)仍然是mPCa治疗的主要手段。ADT作用是限制雄激素的可用性和控制雄激素核异位。雄性激素受体(The androgen receptor,AR)调节剂作为一种转录因子通过与其配体结合域(LBD)结合,指导特异蛋白质的合成及细胞的生长和分化。尽管超过80%的mPCa患者最初对ADT有反应,但最终发展成CRPC。在这个阶段,病人被考虑雄激素耗尽,因此PCa可能独立于AR信号生长。因此研究CRPC的发生机制并从中找到治疗靶标已成为目前研究CRPC的热点。染色体不稳定性是癌症的标志之一,与肿瘤转移有着很大的相关性。SWI/SNF(Switch in mating type/sucrose non fermentation)复合物是染色质重塑复合物中的一种,由 BRG1/BRM,INI1(SMARCB1、BAF47、SNF5),BAF155,BAF170,BAF180和BAF250A亚基组成。染色质重塑复合物SWI/SNF是发育基因表达的重要调控因子。SWI/SNF复合物在各种细胞生物学过程中起重要作用,如细胞周期、肿瘤形成和细胞凋亡。SWI/SNF丢失诱发的癌症发展,与DNA修复、转录、细胞周期调控和核小体定位有关。BRG1基因相关因子155(BRG1-associated factor 155,BAF155)是 SWI/SNF 复合物中的一员,BAF155是在细胞周期蛋白E复合物中被发现的,并能被其相关激酶磷酸化。由于BAF155位于染色体3p221.31上,其中包括一些肿瘤抑制基因,如FUS1和SEM3B,因此BAF155的缺失可能有助于肿瘤的发展,但BAF155在人类前列腺癌PC3细胞中的功能尚未得到完全明确。Med19是Mediator家族的重要成员,在基因转录过程中发挥重要功能,敲除Med19亚基使Mediator复合物的稳定性降低,抑制RNA聚合酶Ⅱ末端磷酸化,从而使转录水平的降低,因此沉默其表达能抑制肿瘤生长和扩散。已有研究表明,中介体复合物亚基19(Mediator Complex Subunit 19;Med 19)参与了多种肿瘤的进展过程,过度表达起促进作用。Med19通过调节CBFA2T3/HEB的表达促进乳腺癌细胞的增殖。Med19能促进非小细胞肺癌细胞增殖迁移能力同时还可增强化疗药物Cisplatin的敏感性。Med19被miR-101-3p/miR-422a靶向,通过调控EGFR/MEK/ERK信号通路促进乳腺癌进展,下调HMGB1信号转导诱导自噬增强阿霉素的化学敏感性。癌细胞浸润前沿的肿瘤-宿主相互作用是一个重要的界面,它包含了癌细胞去分化的动态过程,称为上皮-间充质转化(Epithelial-to-mysenchymal transition;EMT)。EMT 可以通过“肿瘤萌芽”形式进行组织学鉴定,这一特征对于显示浸润性肿瘤生长模式的肿瘤具有高度的特异性。重要的是,肿瘤萌芽和肿瘤边界形态作为额外的预后因素引起了人们的极大兴趣,并且也被国际抗癌联盟所认可。肿瘤转移起初需要细胞侵袭,而侵袭是由EMT启动的。然而,Med19在前列腺癌中的作用尚不明确,因此本研究试图阐明Med19在前列腺癌中,是如何调控EMT启动调节前列腺癌细胞增殖迁移以及凋亡作用的。本文主要进行BAF155和Med19在人前列腺癌细胞中的生物学作用及分子机制研究:1、为了探讨在前列腺癌细胞中增殖、分化与转移中BAF155发挥的作用,本研究利用蛋白质印迹法分析了 BAF155蛋白在PC3中表达水平;2、在PC3、Hela和SNUC2B细胞筛选BAF155蛋白表达水平较高的细胞系,使用慢病毒BAF155-shRNA和BAF155-siRNA分别对BAF155基因进行过表达和干扰,检测BAF155mRNA和蛋白表达情况以及细胞系的增殖情况、侵袭能力和细胞凋亡,验证前列腺癌细胞生物学行为是否受BAF155的调控,为前列腺癌形成的分子机制和后续治疗的研究奠定基础;3、在PC3细胞中,研究敲除Med19-siRNA后细胞敲除效率,Medl9如何调控前列腺癌细胞的增殖迁移作用,Med19是如何影响EMT启动抑制肿瘤细胞增殖迁移作用。研究内容分为以下两大部分:第一部分BAF155在人类前列腺癌PC3细胞中的功能的研究研究目的本研究探讨在人类PC3细胞中BAF155的作用,并进一步解释BAF155表达缺失的作用机制。从而为低分化、非雄激素依赖的前列腺癌的治疗寻找更好的治疗靶点。研究方法1.用免疫印迹方法检测BAF155在PC3细胞中表达情况。2.将野生型BAF155的全长编码序列亚克隆至载体pcDNA3.1(+)中,构建BAF155(pc-BAF155)的超表达载体,并进行测序鉴定。3.将 pcDNA3.1、pc-BAF155、pc-BAF155+si-BAF155 分别转染到细胞中。利用定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,QRT-PCR)检测BAF155的mRNA表达水平,并用免疫印迹检测上述转染BAF155蛋白效率。4.将上述转染BAF155因子的PC3细胞分别用MTT法,凋亡检测和迁移实验检测细胞的活力,凋亡和迁移能力。5.最后用Western blot检测p16和磷脂酰肌醇-3-羟激酶(Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3 K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,AKT)和 WNT/β-catenin通路涉及的相关蛋白的表达水平。6.数据进行统计分析,本研究所有实验均重复3次,实验所得数据用平均值±标准差表示,P<0.05时具有统计学意义。研究结果1.通过研究发现,在Hela细胞中BAF155高表达,BRG1低表达;在PC3细胞中BAF155表达缺失和BRG1低表达;SNUC2B细胞BRG1高表达,但BAF155不表达。2.在PC3细胞中,过表达BAF155能够增加BAF155转录翻译过表达,但是敲除BAF155后,BAF155表达下降。3.过表达BAF155明显抑制PC3细胞的增殖(抑制率为50%)和迁移能力(迁移率抑制率56%),并促进PC3细胞的凋亡(凋亡率28%)(P<0.05),再向细胞中转染si-BAF155后,细胞的迁移能力又出现增加。4.对蛋白表达水平进一步研究表明,细胞中转染pc-BAF155后p16的表达水平显著增加(增长倍数为2.3)(P<0.05),过表达BAF155能够显著抑制p/t-PI3K、p/t-AKT、Wnt3a、β-catenin 和 Wnt5a 的表达水平(P<0.05)(抑制倍数分别为0.78、0.45、0.67、0.63、0.52),从而抑制PC3细胞的增殖,促进凋亡。当再向细胞中转染siRNA-BAF155后,这些蛋白的表达水平又恢复到正常。研究结论在PC3细胞中BAF155具有抑癌作用。BAF155可抑制PC3细胞的增殖和迁移能力,抑制后PC3细胞又重新具有增殖迁移能力。BAF155通过上调p16的表达,下调PI3K/AKT水平,并使WNT/β-catenin通路失活,最终诱导PC3细胞凋亡。本研究结果显示BAF155可以作为一个有效靶点进行深入研究。研究意义本研究首次研究BAF155在前列腺癌细胞中抑癌作用,并发现在PC3细胞中,BAF155可以上调p16,下调PI3K/AKT水平,并使WNT/β-catenin通路失活,最终诱导PC3细胞凋亡。第二部分沉默人类前列腺癌PC3细胞中的Med19基因的基础研究研究目的探讨Med19对人前列腺癌PC3细胞侵袭迁移能力的影响及其在EMT转化过程中的作用机制。研究方法1.采用针对Med 19的siRNA慢病毒载体感染PC3细胞。2.应用QRT-PCR和蛋白质印迹方法(Western blot,WB)检测Med 19-siRNA感染组小干扰 RNA(Small interfering RNA,siRNA)与空载组(scRNA)Medl9 基因转录翻译情况。3.采用Boyden小室侵袭实验、划痕实验检测感染后PC3细胞侵袭、迁移能力变化。4.采用 QRT-PCR 检测感染后 PC3 细胞 E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、ZEB2、Snail-1 和 Snail-2 mRNA 的表达。研究结果1.PC3-Med19-si/sc细胞的建立与表征。在慢病毒感染和FACS分类后,通过荧光显微镜下测定GFP的表达来证实其转导效率。所有细胞的GFP 阳性率均大于95%。2.Med 19-siRNA慢病毒感染PC3细胞后,实验组Med 19 mRNA表达水平比空载组明显降低(基因转录率低18%),差异有统计学意义(P<0.01)3.Med 19-siRNA慢病毒感染Med19蛋白表达水平比空载组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。4.Boyden小室侵袭实验和划痕实验显示感染组细胞侵袭、迁移能力明显减弱(P<0.01)。PC3-Med 19-si 细胞侵袭率为19.71 ±4.00%,而对照 PC3-Med 19-sc细胞的侵袭率为32.27±3.72%(*P<0.05)。PC3-Med 19-si细胞划痕修复区域比率显著小于对照细胞(70.83 ±9.37%v.s.87.33±4.63%,**P<0.01)。5.感染组 N-Cadherin、Vimentin、ZEB2、Snail-1 和 Snail-2 表达降低,E-Cadherin表达升高,在PC3-Med19-sc组和PC3-Med19-si组相比下面蛋白相对灰度均值:N-Cadherin:1±0.12756、0.45586±0.05091;E-Cadherin:1±0.07178、1.78180±0.14847;Vimentin:1±0.07177、0.46652士0.03348;ZEB2:1±0.04083、0.43528±0.04862;Snail-1:1±0.12756、0.58777±0.02400;Snail-2:1±0.04830、0.57435±0.04786。因素方差分析结果显示p<0.05。研究结论沉默Med 19基因可通过抑制EMT中的相关基因从而降低人前列腺癌PC3细胞的转移能力。研究创新性通过本研究首次报道Med19抑制EMT及相关基因的表达,从而前列腺癌细胞增殖迁移能力得到抑制。揭示了 Med19在前列腺癌中重要作用。