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研究背景与目的全球结核病(TB)发病率居高不下,结核病诊断难题是阻碍全球尤其是发展中国家开展防治工作的重要原因。常规诊断方法难以满足临床需求,快速、准确的诊断技术是结核病防控和治疗的关键。本研究旨在验证通过实时荧光定量PCR技术(Q-PCR)检测结核病患者血浆中结核分枝杆菌游离DNA(MTB cfDNA)的可行性,探讨这种新型的分子生物学方法对不同部位结核病的诊断效能,阐明其应用于结核病诊断的临床价值,总结血浆MTB cfDNA检测在临床应用实践中所存在的问题和不足,以期为结核病诊断提供便捷可靠的新技术。研究方法选取2018年7月至2019年6月于广东省第二人民医院和广州市胸科医院收治的临床确诊结核病患者1 18例作为研究对象(研究组),包括肺结核病(PTB)患者79例和肺外结核病(EPTB)患者39例,另选取同期收治的非结核其他肺部疾病患者61例作为对照(对照组)。采用Q-PCR技术检测所有入组患者血浆中MTB cfDNA,结果经基因测序及BLAST分析进一步验证;采用GeneXpert实时荧光定量PCR技术(Xpert MTB/RIF)检测所有入组患者痰液中MTB基因组DNA;同时记录患者临床中结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)及传统细菌学检查结果。采用配对χ2检验比较MTB cfDNA检测法与Xpert MTB/RIF检测法和T-SPOT.TB试验诊断结核病的灵敏性、特异性,比较MTB cfDNA检测法与Xpert MTB/RIF检测法和T-SPOT.TB试验对不同部位结核病患者的阳性检出率。采用Kappa检验比较上述3种诊断方法与临床诊断结果的一致性。进一步分析临床常规诊断方法与血浆MTB cfDNA检测法对结核病的联合诊断价值。结果1.94例临床确诊结核病患者血浆中MTB cfDNA经Q-PCR检测为阳性(基因测序及BLAST 比对分析验证),循环阈值(Ct值)分布于(23.91-37.25)。2.T-SPOT.TB、Xpert MTB/RIF、血浆MTB cfDNA检测法诊断结核病的灵敏性和特异性分别为:81.36%和40.98%、61.02%和96.72%、79.66%和95.08%。MTB cfDNA检测法诊断结核病的灵敏性高于Xpert MTB/RIF检测法(P<0.05),特异性无统计学差异(P>0.05)。MTB cfDNA检测法诊断结核病的特异性高于T-SPOT.TB试验(P<0.05),灵敏性无统计学差异(P>0.05)。3.血浆MTB cfDNA检测法、Xpert MTB/RIF检测法、T-SPOT.TB试验与临床诊断结果的符合率分别为:84.92%、73.18%、67.60%;Kappa相关系数分别为:0.77、0.61、0.43。4.T-SPOT.TB、Xpert MTB/RIF、血浆 MTB cfDNA 检测法对 PTB 和 EPTB患者的阳性检出率分别为:83.54%和76.92%,69.62%和43.59%,79.75%和79.49%。MTB cfDNA检测法对PTB和EPTB患者的阳性检出率均高于Xpert MTB/RIF检测法(P<0.05);与T-SPOT.TB试验相比差异无统计学意义(P>0.05)。5.痰涂片抗酸染色镜检、痰MTB培养、T-SPOT.TB试验、XpertMTB/RIF检测法单独诊断结核病/联合血浆MTB cfDNA检测法诊断结核病的阳性率分别为:33.94%/73.39%、40.32%/70.97%、81.36%/88.14%、61.02%/81.36%。结论1.运用Q-PCR技术可以在结核病患者血浆中检测到MTB cfDNA。2.血浆MTB cfDNA检测法对结核病的诊断灵敏性优于Xpert MTB/RIF检测法,与T-SPOT.TB试验相比能够显著提高对结核病的诊断特异性。血浆MTB cfDNA检测法与临床诊断结果的一致性最好,相较于另外两种诊断方法更可靠。3.血浆MTB cfDNA检测法对PTB和EPTB患者均具有较高的阳性检出率,有望成为EPTB快速诊断的新靶标。4.临床常规诊断方法联合血浆MTB cfDNA检测可有效提高结核病的阳性检出率。5.优化检测质量是需要解决的首要问题,血浆中MTB cfDNA的浓度范围评价应该成为未来研究的重要目标。