背景心肌肥厚是心脏对多种诱发因素作出的一种适应性反应。心脏通过心肌肥厚恢复正常功能,消除外界刺激的影响,但长期的心肌肥厚会发展为心力衰竭或心源性猝死,严重危害人类的健康。目前中国心血管疾病的发生率和死亡率一直居高不下,已成为重大的公共卫生问题,而心肌肥厚是心血管疾病发病和猝死的最危险因素之一。现阶段临床上对于心肌肥厚的治疗只能延缓,因此如何在早期发现和预防心肌肥厚的发生已成为临床关注的焦点。而深入研究心肌肥厚发生的分子机制是解决临床上心肌肥厚早期诊断及新的治疗方法研发等问题的关键。长链非编码RNA是一类长度大于200 nt的非编码RNA,在调控心脏发育及心血管疾病的过程中发挥着重要作用。mhrt是肌球蛋白重链7的编码基因通过可变剪切产生的lncRNA分子,可通过Brg1抑制心肌肥厚的发生,发挥保护心脏的作用,并且在小鼠和人的体内mhrt的功能是高度保守的,这就预示着mhrt具有成为临床诊断和治疗心肌肥厚分子靶点的潜力。而lncRNA的调控机制比较复杂,可以在多个层面调控机体的生理功能,特别是其能够与miRNA或者转录因子之间构成分子调控网络,共同行使调控功能。而myocardin作为诱导心肌肥厚发生的关键转录因子,其对于机体发育、疾病发生的调控功能及分子机制已被广泛关注与探讨。但是在心肌肥厚的发生、发展过程中,作为心肌肥厚负调控因子的mhrt与myocardin之间是否存在相互联系尚不清楚。并且目前关于mhrt调控心肌肥厚的相关分子机制研究较少,尤其是mhrt与myocardin及心肌肥厚之间的关系在国内外至今尚未有人报道,因此针对mhrt与myocardin之间的相互作用与机制的研究对于心肌肥厚发生发展的分子机制的补充具有重要意义和价值。目的本研究利用分子生物学、细胞生物学等技术手段在分子水平、细胞水平、动物水平上揭示mhrt与myocardin之间的相互作用及分子机制,并探索两者之间的相互关系在心肌肥厚发生发展中的调控作用,进一步完善心肌肥厚发生发展的分子机制,为临床上心肌肥厚的防治提供早期诊断和治疗靶标。方法第一部分:在原代小鼠心肌细胞中利用慢病毒转导的方式过表达myocardin,然后过表达或敲降mhrt,结合RT-PCR、Western Blot和免疫荧光实验检测心肌肥厚相关标志基因(ANP,β-MHC,ACTN2)的表达,探索mhrt是否影响myocardin对心肌肥厚的调控功能。同时通过RT-PCR和Western Blot实验探索mhrt是否能够调控myocardin的表达;第二部分:利用生物信息学、pathway分析预测,结合RT-PCR、Western Blot、免疫荧光、免疫组化、H&E染色等实验在分子水平、细胞水平和动物水平探索mhrt是否能够通过KLF4调节myocardin的表达及心肌肥厚。然后进一步探索mhrt调节KLF4表达的分子机制:(1)利用miRcode、mibase等生物信息学软件分析预测,结合RNA原位杂交、荧光素酶活性分析、RIP、MS2-RIP等实验探索mhrt是否通过与miR-145a-5p结合,调节KLF4 mRNA的表达,发挥竞争性内源RNA的功能;(2)由于KLF4蛋白的磷酸化修饰可以被ERK信号通路调控,进而发生泛素化修饰导致蛋白降解,因此利用免疫共沉淀实验探索mhrt是否能够调节KLF4蛋白的磷酸化水平。随后利用RPISEQ软件探索mhrt与KLF4蛋白之间是否存在直接结合作用,并通过免疫共沉淀、RNA pull down、RIP等实验加以证实。最后通过ERK激动剂和ERK抑制剂结合免疫共沉淀实验探索mhrt是否通过与ERK竞争性地结合KLF4导致其磷酸化水平降低,揭示mhrt调控KLF4蛋白磷酸化的分子机制。第三部分:myocardin蛋白正常功能的维持与其乙酰化水平相关,且HDAC5能够诱导myocardin蛋白去乙酰化。因此在原代小鼠心肌细胞中利用免疫共沉淀、荧光素酶活性分析及免疫荧光实验探索mhrt是否通过HDAC5调节myocardin蛋白的乙酰化水平及其分子机制;第四部分:在原代小鼠心肌细胞中利用慢病毒转导的方式过表达或敲降myocardin,结合RT-PCR、Western Blot实验探索myocardin是否能够反向调节mhrt的表达;在mhrt启动子区域利用UCSC、TargetScan软件判断myocardin/SRF复合物的作用位点(CarG Box),并通过荧光素酶活性分析及染色质免疫共沉淀实验进行验证。结果第一部分:RT-PCR、Western Blot及免疫荧光实验结果证实mhrt能够显著抑制myocardin对心肌肥厚的促进作用,并且mhrt可以在RNA水平和蛋白水平上抑制myocardin的表达;第二部分:对mhrt调控myocardin表达的分子机制进行探索,发现mhrt可以通过KLF4调控myocardin的表达及心肌肥厚的发生。(1)RT-PCR和Western blot实验结果证实mhrt可促进KLF4的表达;(2)进一步的体内外实验结果证实,敲降KLF4之后,mhrt失去了调控myocardin表达及心肌肥厚的功能,说明mhrt是通过KLF4调控myocardin表达及心肌肥厚的;(3)对mhrt调节KLF4表达的分子机制进行进一步的研究,发现mhrt可以在两个层面调控KLF4的表达:一方面,mhrt能够以竞争性内源RNA的方式吸附miR-145a-5p,释放下游靶基因KLF4的mRNA,上调KLF4 mRNA的水平;另一方面,mhrt可通过与ERK1/2竞争性结合KLF4蛋白,抑制KLF4蛋白发生磷酸化修饰,防止其进一步被泛素化修饰、降解,从而上调KLF4蛋白的水平;第三部分:免疫共沉淀及荧光素酶活性分析实验结果证实mhrt能够显著抑制myocardin蛋白的乙酰化水平,并且这一过程是通过介导HDAC5实现的;进一步的免疫荧光实验结果发现mhrt是通过促进HDAC5的入核,进而抑制myocardin蛋白的乙酰化水平,降低myocardin蛋白与下游靶基因的亲和性,抑制激活心肌肥厚的相关基因表达;第四部分:RT-PCR的实验结果证实myocardin可以反向激活mhrt的表达,并且进一步的荧光素酶活性分析及染色质共沉淀实验结果发现myocardin是通过与mhrt启动子区域邻近转录起始位点的CarG Box结合进而促进mhrt表达的。结论心肌肥厚的发生受到了多因子的共同调控。这些转录因子、miRNA和lncRNA之间相互作用,构成一个庞大的分子网络,共同调控心肌肥厚的发生发展。在这里,我们首次发现了在心肌肥厚发生、发展的过程中,mhrt与myocardin之间的相互作用及其分子机制,并揭示了mhrt与miR-145a-5p、KLF4、HDAC5以及myocardin之间构成的新的调控心肌肥厚的分子网络。其中mhrt调控KLF4表达的分子机制、mhrt调控myocardin表达和蛋白活性的分子机制、“lncRNA-mhrt/miR-145a-5p/KLF4/myocardin”信号通路的揭示均是本研究的创新点。本研究的结果为阐明心肌肥厚的发生机制提供了新的理论基础,同时也为心肌肥厚的临床治疗提供了新的靶标。