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研究背景流行病学研究表明,随着感染性眼病控制,新生血管性眼病已成为发达国家失明的重要原因,而视网膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)性疾病是目前主要的致盲眼病,但目前的治疗效果均不理想。新生血管的生成是血管内皮细胞不断分裂增殖和迁移的复杂过程,目前用于治疗研究的药物主要有血管生成因子表达的抑制剂如抗VEGF抗体和内源性血管生成抑制因子如内皮抑素(Endostatin, ES)等,肿瘤抑素是迄今发现活性最强的内源性血管生成抑制因子,对病理性新生血管生成有明显抑制作用。目的构建及鉴定经信号肽优化后带有HA-tag标记的携带人肿瘤抑素(Tumstatin)活性片段Tum-5基因真核表达载体并研究抗肿瘤血管生成抑制基因Tum-5对恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞(rhesus choroidoretinal endothelial cell, RF/6A)生长的影响。方法本研究包括两部分：1.设计并构建经信号肽优化后带有HA-tag标记的携带Tum5重组基因真核表达载体PCMV-Tum5-MCS,通过酶切、测序验证Tum5基因构建情况；2.利用脂质体Lipofectamine2000转染系统将PCMV-Tum5-MCS质粒载体转染入体外培养的RF/6A细胞(转染实验组),同时设置空质粒载体阴性对照组和未转染组；采用Dot blot方法用HA抗体检测细胞上清液中Tum5蛋白的表达水平；通过MTT法检测细胞转染后24h、48h和72h三个不同时相点细胞增殖抑制率；利用体外细胞划痕试验,分别考察在0h、24h、48h三个不同时相点,Tumm5与RF/6A迁移与侵袭的关系；运用流式细胞术比较三组细胞转染48h后细胞周期情况。结果1.经过酶切,测序鉴定PCMV-Tum5-MCS真核表达载体构建成功；2.瞬时转染Tumm-5载体构建成功；3.Dot blot法检测出Tum5基因在RF/6A细胞上清中蛋白表达成阳性；4.转染后24h、48h和72h,转染实验组细胞增殖抑制率均明显高于空白对照组和空质粒阴性对照组(P<0.05),其中各组细胞转染72h后增殖抑制率均高于48h、24h(P<0.05)；5.细胞划痕实验结果表明,Tum5基因对RF/6A细胞的迁移率较空白对照组及阴性对照组明显下降(P<0.05)；6.流式细胞术结果显示：正常细胞组G1期72.32%G2期7.22%S期20.46%,空质粒载体阴性对照组G1期75.92%G2期3.23%S期20.84%PCMV-Tum5-MCS质粒载体转染组G1期65.21%G2期4.79%S期30.00%,PCMV-Tum5-MCS质粒载体转染组G1期比例下降,S期比例显著上升,正常细胞组和空质粒载体转染组没有明显差异。结论成功构建了携带Tum5基因的真核表达载体,体外转染RF/6A后能够稳定表达Tum5基因,具有抑制RF/6A增殖,移行的功能,使细胞周期阻滞于S期。为进一步研究Tum5的功能和眼部新生血管疾病的治疗奠定基础。