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目的:研究人/大鼠异源HER2特异性囊泡(exosome,EXO)靶向的T细胞(Hu Rt-TEXO)疫苗免疫治疗HER2+乳腺癌的作用。方法:1)通过常规DNA重组技术构建表达人HER21-407aa(Hu)和大鼠neu408-690aa(Rt)融合蛋白(Hu Rt)的pshuttle-CMV-Hu Rt重组转移质粒。将构建正确的pshuttle-CMV-Hu Rt重组转移质粒经Pme I酶切后与RGD修饰的p Ad Easy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,得到的同源重组腺病毒质粒p Ad Easy-1-pshuttle-CMV-Hu Rt(简称为p Ad-Hu Rt)经Pac I酶切后再用脂质体Lipofectamine2000转染293人胚肾细胞包装出毒获得Ad VHu Rt重组腺病毒,并Ad VHu Rt经多轮感染293细胞中进行扩增、纯化。2)野生型小鼠BALB/c(H-2Kd)、双转基因小鼠HLA-A2/HER2(HLA-A2,HLA-A2限制性的人HER2特异性自身免疫耐受)的骨髓来源树突状细胞(BM-DC)培养,并Ad VHu Rt、Ad VHER2感染后收集DC上清超高速离心制备EXOHu Rt(H-2K d)、EXOHER2(H-2K d);EXOHu Rt(HLA-A2)、EXOHER2(HLA-A2)。3)BALB/c、HLA-A2/HER2小鼠的脾细胞用刀豆蛋白Con A刺激活化后,再用小鼠CD4+T细胞分离试剂盒纯化活化的CD4+T细胞(CD4+TH-2K d、CD4+THLA-A2)。4)CD4+TH-2K d分别与EXOHu Rt(H-2K d)、EXOHER2(H-2K d)共孵育获得BALB/c(H-2Kd)来源的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO疫苗,用于BALB/c小鼠的疫苗接种;CD4+THLA-A2分别与EXOHu Rt(HLA-A2)、EXOHER2(HLA-A2)共孵育获得HLA-A2/HER2(HLA-A2)来源的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO疫苗,用于HLA-A2/HER2小鼠的疫苗接种。5)BALB/c(H-2Kd)来源的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO(用于对照)疫苗尾静脉注射免疫BALB/c小鼠6天后,FITC-CD4抗体、PE-CD44抗体染色后流式细胞术检测CD4+T细胞免疫反应;FITC-CD8抗体、PE-Tetramer染色后流式细胞术检测HER2特异性CD8+CTL反应。并且CFSE高浓度(HER2抗原肽负载,用作靶细胞)、CFSE低浓度(不相关抗原肽负载,阴性对照靶细胞)标记的BALB/c小鼠脾细胞尾静脉注射于Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO免疫6天的BALB/c小鼠,通过流式细胞术检测脾脏中CFSE高、低浓度靶细胞的残余,分析Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO刺激的CTL介导的H-2Kd限制性HER2特异性杀伤效应。初次免疫30天后,用Ad VHER2感染BALB/c来源的BM-DC(DCHER2)尾静脉注射加强免疫4天后,FITC-CD8抗体、PE-Tetramer染色后流式细胞术检测HER2特异性CD8+CTL的再次免疫应答能力。6)BALB/c(H-2Kd)来源的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO(用于对照)疫苗尾静脉注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周一次,共两次。在第二次免疫三周后收获免疫小鼠的血清,然后通过用HER2-结合酶联免疫吸附实验(ELISA)测量血清中抗HER2抗体的浓度检测HER2特异性抗体免疫反应。7)人HER2表达的转基因小鼠乳腺癌细胞4T1HER2分别尾静脉、皮下注射建立早期的肺转移瘤、皮下移植瘤后,BALB/c(H-2Kd)来源制备的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO(用于对照)疫苗尾静脉注射免疫,分析Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO介导的治疗性抗肿瘤免疫。8)HLA-A2/HER2(HLA-A2)来源的Hu Rt-TEXO和HER2-TEXO(用于对照)疫苗尾静脉注射免疫双转基因HLA-A2/HER2小鼠。免疫6天后,皮下接种HLA-A2、HER2表达的转基因小鼠黑色素瘤细胞BL6-10A2/HER2进行肿瘤挑战,分析克服HER2特异性自身免疫耐受及预防性抗肿瘤免疫的能力。9)HLA-A2/HER2(HLA-A2)来源的Hu Rt-TEXO疫苗尾静脉注射免疫双转基因HLA-A2/HER2小鼠。免疫6天后纯化脾细胞中的CD8+T细胞,用照光过的Ad VHER2感染HLA-A2/HER2小鼠来源的BM-DC(DCHER2)体外再刺激,扩增后纯化制备HLA-A2限制性HER2特异性CD8+CTLs,并分析其对HLA-A2转基因的曲妥珠单抗耐药人HER2+乳腺癌细胞HLA-A2+HER2+BT474A2的杀伤活性。10)曲妥珠单抗耐药人HER2+乳腺癌细胞HLA-A2+HER2+BT474A2皮下接种无胸腺BALB/c裸鼠建立乳腺癌皮下移植瘤,然后用再刺激扩增的HLA-A2限制性HER2特异性CD8+CTLs尾静脉注射过继治疗,分析其对裸鼠体内曲妥珠单抗耐药HER2+乳腺癌HLA-A2+HER2+BT474A2移植瘤的治疗作用。结果:1)成功构建了表达人HER21-407aa(Hu)和大鼠neu408-690aa(Rt)融合蛋白(Hu Rt)的重组腺病毒Ad VHu Rt,并制备了人/大鼠异源HER2(Hu Rt)特异性囊泡靶向的T细胞(Hu Rt-TEXO)疫苗。2)在BALB/c野生型小鼠中,Hu Rt-TEXO疫苗较HER2-TEXO刺激了更强的CD4+T细胞反应,CD4+CD44+T细胞数量占外周血总CD4+T细胞的百分比分别为29.4%、23.1%(P<0.05);Hu Rt-TEXO(血清抗HER2抗体量达70μg/ml)刺激HER2特异性体液免疫反应的能力也强于HER2-TEXO(40μg/ml)(P<0.05)。3)在BALB/c小鼠中,Hu Rt-TEXO疫苗较HER2-TEXO刺激了更强的HER2特异性CD8+CTL反应。Hu Rt-TEXO疫苗诱导的HER2特异性CD8+CTL占外周血总CD8+T细胞的百分比可达2.28%,体内杀伤了90%的HER2特异性靶细胞;而对照HER2-TEXO疫苗诱导的HER2特异性CD8+CTL只有1.31%,杀伤了53%的HER2特异性靶细胞(P<0.05)。并且Hu Rt-TEXO(3.51%)较HER2-TEXO(1.54%)刺激了更强的HER2特异性CTL免疫记忆(P<0.05)。4)Hu Rt-TEXO疫苗能够明显抑制在BALB/c小鼠中建立的早期4T1HER2小鼠乳腺癌肺转移瘤和皮下移植瘤的生长。与HER2-TEXO比较,Hu Rt-TEXO诱导了更强的治疗性抗肿瘤免疫(P<0.05)。5)在双转基因HLA-A2/HER2小鼠中,Hu Rt-TEXO疫苗完全(8/8)预防了表达HLA-A2、HER2的BL6-10A2/HER2黑色素瘤的生长,而HER2-TEXO疫苗只预防了3/8小鼠肿瘤的生长(P<0.05)。Hu Rt-TEXO更有效克服HER2的自身免疫耐受和增强HER2特异性的预防性抗肿瘤免疫。6)体外扩增的HLA-A2限制性、HER2特异性CTLs对曲妥珠单抗耐药的HLA-A2、HER2表达的BT474 A2人乳腺癌细胞在体外、裸鼠体内均具有明显的杀伤活性,几乎能根除已建立的3-4mm直径的BT474A2乳腺癌移植瘤的生长。结论:人/大鼠异源HER2特异性囊泡靶向的T细胞疫苗Hu Rt-TEXO能够增强HER2特异性体液、T细胞免疫反应,更有效打破HER2的自身免疫耐受,进而增强Hu Rt-TEXO疫苗诱导的保护性抗肿瘤免疫。Hu Rt-TEXO,一种潜在的HER2+乳腺癌治疗性疫苗,可能为曲妥株单抗耐药的HER2+乳腺癌病人提供一种新的治疗选择。