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第一部分HepG2.2.15细胞培养及HBV活性与亚型鉴定目的:鉴定HepG2.2.15细胞乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)活性及亚型。方法:常规培养HepG2.2.15细胞,收集6孔板对数生长期的培养上清液和细胞,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HBsAg、HBeAg和HBcAb水平;实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)测定HBV-DNA浓度;高通量基因测序技术鉴定HBV亚型;分子杂交技术检测HBV基因型及耐药突变情况;细胞免疫组化法检测细胞内HBsAg及HBeAg表达。将细胞设0.25、0.5、1.0、2.0和4.0×10~5个/mL五个培养浓度,每隔48h收集培养上清液,连续收集5次,检测HBeAg和HBV-DNA的含量。结果:HBV活性测定结果:HBsAg(OD值)为0.36±0.11;HBeAg(OD值)为2.37±0.08;HBcAb(OD值)为1.73±0.17;HBV-DNA为(4.75±0.06)×10~5IU/mL。病毒S、C区基因测序后序列比对结果显示与HBV ayw亚型相符,符合率大于99%。HBV基因分型为B、D复合型,无耐药突变位点。细胞免疫组化检测结果显示胞内HBsAg和HBeAg均呈阳性表达。细胞浓度为1.0×10~5个/mL时,增殖较快、较稳定,细胞状态最佳。结论:HepG2.2.15细胞HBV活性表达良好,无耐药突变位点,可作为体外HBV相关研究的良好模型。第二部分HBV C编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定目的:针对HBV C区编码链设计、筛选及鉴定出能特异性阻断Hep G2.2.15细胞内HBV复制与表达的有效治疗靶点的反基因锁核酸(locked nucleic acid,LNA)片段。方法:利用RNAstructure5.0软件针对HBV C区编码链1914~1928nt、1969~1983nt、2002~2016nt、2053~2067nt、2069~2073nt、2162~2176nt和2404~2418nt位点设计合成7条(分别以SQ1-7表示)反基因LNA片段,以阳离子脂质体lipofectamine 3000(lipo3000)介导转染Hep G2.2.15细胞,分别于给药后第3、6、9 d收集培养上清液,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HBe Ag水平;实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)测定HBV-DNA浓度。进行LNA药物/lipo3000最佳比例的筛选。结果:针对HBV C区编码链2162~2176nt和2404~2418nt位点的反基因LNA片段(即SQ6和SQ7)对HBV-DNA复制和HBe Ag表达的抑制效果最明显,用药后第3、6、9 d,SQ6对HBe Ag的平均抑制率分别为43.91%、59.95%和59.07%,HBV-DNA分别为42.91%、50.11%和51.14%;SQ7对HBe Ag的平均抑制率分别为44.18%、60.81%和60.02%,HBV-DNA分别为47.26%、54.16%和52.22%。LNA药物/lipo3000比例为4μg/6μL时,抑制效果最明显,用药后第3、6、9 d,SQ6对HBe Ag平均抑制率分别为44.16%、60.14%和60.27%,HBV-DNA分别为47.71%、56.66%和53.26%。结论:针对HBV C区编码链2162~2176nt和2404~2418nt位点的反基因LNA片段抗HBV效果最佳,且反基因LNA药物与lipo3000最适比例为4μg/6μL。第三部分HBV C编码链反基因锁核酸体外抗HBV效果研究目的:探讨HBV C编码链反基因LNA体外抗HBV效果。方法:利用RNAstructure5.0软件针对HBV C区编码链2162~2176nt、2404~2418nt位点分别设计合成反基因LNA片段(即SQ6、SQ7)。实验设空白对照组、lipo3000对照组、无关序列对照组(USQ)、恩替卡韦(ETV)对照组、SQ6和SQ7实验组,以lipo3000介导Hep G2.2.15细胞,各组隔天对应给药,连续5次,收集给药后第2、4、6、8、10 d的培养上清液,收集第10 d的细胞,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测上清液HBe Ag水平;实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测上清液HBV-DNA含量;逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测细胞内HBV C m RNA表达。采用CCK8实验和流式细胞技术检测反基因LNA对细胞增殖和凋亡的影响。结果:用药后第2、4、6、8、10 d,SQ6组对HBe Ag的平均抑制率分别为34.86%、47.99%、61.62%、61.51%和59.49%,对HBV-DNA的平均抑制率分别为33.38%、54.97%、59.99%、53.94%和50.59%,SQ6与相比,P<0.001;SQ7组对HBe Ag的平均抑制率分别为36.33%、50.93%、64.67%、62.45%和61.36%,对HBV-DNA的平均抑制率分别为33.71%、55.82%、61.17%、54.95%和51.82%,SQ7与其余各组相比,P<0.001。空白对照组、lipo3000对照组、USQ、ETV、SQ6和SQ7组HBV C m RNA扩增产物与内参基因扩增产物(设为1)电泳灰度比值分别为0.973±0.017、0.967±0.011、0.969±0.019、0.602±0.013、0.376±0.009和0.371±0.007。CCK8和流式细胞实验结果显示反基因LNA对细胞增殖、凋亡无明显影响。结论:针对HBV C编码链2162-2176 nt和2404-2418nt位点的反基因LNA能有效抑制Hep G2.2.15细胞内HBV复制与表达,且对细胞增殖、凋亡无明显影响。